W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurony arboryzacji dendrytycznej (da) obwodowego układu nerwowego (PNS) Drosophila stanowią doskonały system modelowy do badania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw specyficznej dla danej klasy morfogenezy dendrytów1,2. Aby umożliwić analizy molekularne rozwoju neuronów da specyficznych dla danej klasy, kluczowe jest uzyskanie tych komórek w postaci czystej populacji. Choć dla komórek Drosophila istnieje szereg różnych technik izolacji RNA specyficznych dla komórek i tkanek, w tym oczyszczanie komórek z użyciem kulek magnetycznych3,4, sortowanie komórek metodą FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting)5-8 oraz strategie oparte na białkach wiążących RNA9, żadna z tych metod nie może być łatwo wykorzystana do izolacji pojedynczych lub wielu neuronów da Drosophila specyficznych dla danej klasy z wysoką precyzją przestrzenną. Mikrodysekcja sterowana laserem (LCM) okazała się niezwykle potężnym narzędziem, które można wykorzystać do izolowania specyficznych typów komórek z przekrojów tkanek z wysoką rozdzielczością i dokładnością przestrzenną. RNA uzyskane z izolowanych komórek może być następnie wykorzystane do analiz, w tym qRT-PCR i profilowania ekspresji za pomocą mikromacierzy w obrębie danego typu komórek10-16. Do tej pory LCM nie było szeroko stosowane w analizie tkanek i komórek Drosophila17,18, w tym neuronów da w trzecim stadium larwalnym rozwoju.
W niniejszej pracy przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji neuronów da Drosophila z wykorzystaniem podczerwonego (IR) rodzaju LCM. Metoda ta umożliwia wychwyt pojedynczych, specyficznych dla danej klasy lub wielu neuronów da z wysoką specyficznością i rozdzielczością przestrzenną. W eksperymentach wykorzystano larwy trzeciego stadium o tym samym wieku, wykazujące ekspresję transgenu UAS-mCD8::GFP19 pod kontrolą specyficznego dla klasy IV neuronów da drivera ppk-GAL420 lub pan-neuronowego drivera 21-7-GAL421. RNA uzyskane z izolowanych neuronów da charakteryzuje się bardzo wysoką jakością i może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach, w tym w qRT-PCR lub analizach mikromacierzy. Co więcej, niniejszy protokół LCM można łatwo dostosować do wychwytu innych typów komórek Drosophila na różnych etapach rozwoju, w zależności od specyficznego dla danego typu komórek wzorca ekspresji GFP sterowanej przez GAL4.
Protokół
Ogólne uwagi dotyczące LCM neuronów obwodowych Drosophila
Czas trwania procesu LCM może wynosić od 6 godzin do tygodnia lub więcej, w zależności od rodzaju tkanki oraz wymaganej liczby komórek.
Wszystkie procedury przeprowadzono w ścisłych warunkach wolnych od RNazy, zgodnie ze standardowymi procedurami. W eksperymentach tych wykorzystano larwy linii reporterowych transgenicznych wykazujących ekspresję 21-7-GAL4,UAS-mCD8::GFP lub ppk-GAL4,UAS-mCD8::GFP.
1. Przygotowanie larw
- Zebrać 30-40 larw trzeciego stadium o podobnym wieku i przemyć je wodą ddH....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół opisuje naszą zoptymalizowaną metodę izolacji neuronów obwodowych Drosophila za pomocą LCM. Choć ten protokół LCM został opracowany do specyficznej izolacji pojedynczych, klasowo specyficznych lub wielu neuronów da Drosophila z trzeciego stadium larwalnego rozwoju, niewielkie modyfikacje procedury mogą zostać łatwo dostosowane do pobierania innych typów komórek Drosophila ze wszystkich etapów rozwoju, przy użyciu odrębnych transgenów raportujących GAL4,UAS-mCD8-.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr. Yuh-Nung Janowi oraz dr. Wesowi Grueberowi za udostępnienie szczepów muszek wykorzystanych w niniejszym badaniu, a także Virginii Espinie, dr. Emanuelowi Petricoinowi i dr. Lance'owi Liottie za pomoc w przeprowadzeniu LCM. Autorzy dziękują Thomas F. and Kate Miller Jeffress Memorial Trust za wsparcie niniejszych badań (D.N.C.) oraz Biuru Prorektora George Mason University (E.P.R.I.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10X roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS) | MP Biomedicals | PBS10X02 | Rozcieńczony do 1X roztworu roboczego |
| 2,5% trypsyny | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | |
| Ksyleny, stopień histologiczny | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| woda wolna od RNaz | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| związek OCT (Optimal Cutting Temperature) | Tissue-Tek | 4583 | |
| Zestaw do izolacji RNA PicoPure | Molecular Devices | KIT0204 | Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta’instrukcje |
| Cienkościenna probówka reakcyjna z kopułkową zakrętką | Applied Biosystems | N8010611 | |
| Urządzenie do ekstrakcji próbek ExtracSure | Molecular Devices | LCM 0208 | |
| Blok inkubacyjny do ekstrakcji próbek z kapsułek CapSure HS | Molecular Devices | LCM0505 | |
| Kasetka do pozycjonowania nakładek CapSure HS LCM oraz urządzeń do ekstrakcji próbek ExtracSure | Molecular Devices | LCM0504 | |
| nakrętki CapSure HS LCM | Molecular Devices | LCM0213 | |
| szkiełka przedmiotowe 75x100 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Formy do zatapiania tkanek | Fisher Scientific | NC9642669 | |
| Tłuczek polipropylenowy do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml | USA Scientific, Inc. | 1415-5390 | |
| 70% etanol; 95% etanol; 100% etanol | |||
| Suchy lód | |||
Sprzęt:
|
Bibliografia
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
