W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurony arboryzacji dendrytycznej (da) obwodowego układu nerwowego (PNS) Drosophila stanowią doskonały system modelowy do badania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw specyficznej dla danej klasy morfogenezy dendrytów1,2. Aby umożliwić analizy molekularne rozwoju neuronów da specyficznych dla danej klasy, kluczowe jest uzyskanie tych komórek w postaci czystej populacji. Choć dla komórek Drosophila istnieje szereg różnych technik izolacji RNA specyficznych dla komórek i tkanek, w tym oczyszczanie komórek z użyciem kulek magnetycznych3,4, sortowanie komórek metodą FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting)5-8 oraz strategie oparte na białkach wiążących RNA9, żadna z tych metod nie może być łatwo wykorzystana do izolacji pojedynczych lub wielu neuronów da Drosophila specyficznych dla danej klasy z wysoką precyzją przestrzenną. Mikrodysekcja sterowana laserem (LCM) okazała się niezwykle potężnym narzędziem, które można wykorzystać do izolowania specyficznych typów komórek z przekrojów tkanek z wysoką rozdzielczością i dokładnością przestrzenną. RNA uzyskane z izolowanych komórek może być następnie wykorzystane do analiz, w tym qRT-PCR i profilowania ekspresji za pomocą mikromacierzy w obrębie danego typu komórek10-16. Do tej pory LCM nie było szeroko stosowane w analizie tkanek i komórek Drosophila17,18, w tym neuronów da w trzecim stadium larwalnym rozwoju.
W niniejszej pracy przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji neuronów da Drosophila z wykorzystaniem podczerwonego (IR) rodzaju LCM. Metoda ta umożliwia wychwyt pojedynczych, specyficznych dla danej klasy lub wielu neuronów da z wysoką specyficznością i rozdzielczością przestrzenną. W eksperymentach wykorzystano larwy trzeciego stadium o tym samym wieku, wykazujące ekspresję transgenu UAS-mCD8::GFP19 pod kontrolą specyficznego dla klasy IV neuronów da drivera ppk-GAL420 lub pan-neuronowego drivera 21-7-GAL421. RNA uzyskane z izolowanych neuronów da charakteryzuje się bardzo wysoką jakością i może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach, w tym w qRT-PCR lub analizach mikromacierzy. Co więcej, niniejszy protokół LCM można łatwo dostosować do wychwytu innych typów komórek Drosophila na różnych etapach rozwoju, w zależności od specyficznego dla danego typu komórek wzorca ekspresji GFP sterowanej przez GAL4.
Protokół
Ogólne uwagi dotyczące LCM neuronów obwodowych Drosophila
Czas trwania procesu LCM może wynosić od 6 godzin do tygodnia lub więcej, w zależności od rodzaju tkanki oraz wymaganej liczby komórek.
Wszystkie procedury przeprowadzono w ścisłych warunkach wolnych od RNazy, zgodnie ze standardowymi procedurami. W eksperymentach tych wykorzystano larwy linii reporterowych transgenicznych wykazujących ekspresję 21-7-GAL4,UAS-mCD8::GFP lub ppk-GAL4,UAS-mCD8::GFP.
1. Przygotowanie larw
- Zebrać 30-40 larw trzeciego stadium o podobnym wieku i przemyć je wodą ddH2O, a następnie krótko opłukać preparatem RNAse Away (Sigma-Aldrich) i końcowo przemyć wodą ddH2O w celu usunięcia RNAse Away. Przed zatopieniem larw w OCT całkowicie osuszyć nadmiar wody ddH2O za pomocą czystej chusteczki Kimwipe.
- Wziąć czystą formę do zatapiania tkanek i nałożyć cienką (1,5-2 mm) warstwę OCT, wystarczającą do przykrycia pojedynczej warstwy larw.
- Przed zatapianiem larw, w razie potrzeby, schłodzić OCT w formach do 0°C. W tym celu należy umieścić formę z OCT na bloku lodu. Pomoże to ograniczyć ruchy larw podczas procesu zatapiania.
- Umieścić czyste larwy na schłodzonym OCT i ułożyć je równolegle jedna do drugiej. Po ułożeniu larw powoli wypełnić formę OCT, nie zaburzając ich rozmieszczenia. Gwałtownie zamrozić formę, umieszczając ją na bloku suchego lodu. [Kluczowy etap: Natychmiastowe zamrożenie larw w celu ograniczenia ich ruchu.] Metoda ta pozwoli na rozmieszczenie larw w jednej płaszczyźnie, co zmaksymalizuje liczbę komórek dostępnych do pobrania w każdym przekroju.
Jeśli konieczne jest zachowanie morfologii tkanki w celu identyfikacji komórek zainteresowania lub jeśli oczekiwana liczba komórek na przekrój jest satysfakcjonująca, należy przejść bezpośrednio do kroku 1.
Alternatywnie, jeśli komórki są specyficznie znakowane i można je zidentyfikować za pomocą łatwo rozpoznawalnego markera, takiego jak GFP lub RFP, ale liczba komórek na przekrój jest zbyt niska, kroki 5–10 mogą pomóc w zwiększeniu liczby komórek dostępnych do przechwycenia na przekrój. Są to kroki opcjonalne i należy je rozważyć tylko w razie potrzeby, jako metoda zwiększenia liczby neuronów da dostępnych do LCM na przekrój, gdy inna metoda nie przynosi korzystnych rezultatów. [Uwaga: Ta metoda może zaburzyć ogólną morfologię tkanki i znacznie utrudnić identyfikację tkanki na podstawie konkretnej lokalizacji przestrzennej.]
- Przemyć 50-70 larw w trzecim stadium rozwojowym zgodnie z opisem w kroku 1. Umieścić larwy w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej 50 μl 1X PBS wolnego od RNaz.
- Rozetrzeć larwy za pomocą polipropylenowego tłuczka (USA Scientific), wykonując 6-7 powolnych, mocnych ruchów.
- Odwirować roztwór przy 16 0 (x) g przez 5-10 sekund (aż kutykule larw opadną na dno probówki). Odrzucić nadsącz. Osad powinien składać się głównie z kutykuli larwy, do której ściśle przylegają PNS, w tym neurony da.
- Przemyć osad z kutykuli 2-3 razy w 1X PBS i resuspenderć osad w 50 μl 1X PBS. Odwirować roztwór przy 16 00 (x) g przez 1 minutę, aby uzyskać zwarty osad. Całkowicie odessać nadsącz za pomocą cienkiej pipety Pasteura.
- Ostrożnie usunąć osad z probówki za pomocą czystej szpatułki i odsączyć nadmiar PBS za pomocą czystej chusteczki Kimwipe. [Uwaga: Ważne jest, aby utrzymać osad w jak najbardziej zwartej formie, aby zwiększyć uzysk komórek]. Umieścić zwarty osad kutykuli na plastikowej formie zawierającej cienką warstwę OCT (ok. 1 mm).
- Delikatnie rozprzestrzenić osad na cienkim obszarze kolistym. Wypełnić formę OCT i zamrozić tkankę zgodnie z opisem w kroku 4.
- Za pomocą kriotomu wyciąć zamrożone sekcje o grubości 5-8 μm na zwykłych, opisanych, nieładowanych, wolnych od RNaz szklanych przedmiotach szkiełek mikroskopowych. [Kluczowy krok: Umieścić sekcje tkankowe blisko środka szkiełka.]
- Przechowywać szkiełka bezpośrednio na suchem lodzie lub w temperaturze -80°C w czystym pudełku na szkiełka aż do momentu mikrodysekcji. Procedurę LCM najlepiej przeprowadzić w ciągu tygodnia od wykonania sekcji tkanki.
MOMENT PRZERWY
2. Dehydratacja i usuwanie kutykuli z zamrożonych przekrojów larw
[Kluczowy etap: Wszystkie roztwory do odwodnienia muszą być przygotowane na świeżo przed każdą sesją LCM. Całkowite odwodnienie zamrożonych sekcji tkanek larwalnych jest niezbędne do osiągnięcia optymalnej wydajności mikrodysekcji]
- Wyjmij slajdy zawierające mrożone sekcje tkanek larwalnych z zamrażarki o temperaturze -80°C i umieść je na suchym lodzie.
- Wyjmij pojedynczy slajd z suchego lodu i natychmiast umieść go bezpośrednio w stożkowatej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 70% ethanol fiksatywem, a następnie krótko wypłucz w RNAse-free ddH2O zgodnie z zalecanymi czasami przedstawionymi w Tabeli 1.
- Obecność kutykuli larwalnej w mrożonych sekcjach może upośledzać wydajność przechwytywania, zapobiegając efektywnemu kontaktowi kapsułki LCM z komórką, co może prowadzić do niespecyficznego przechwytywania. W razie potrzeby przeprowadź następujące kroki (4-5), aby usunąć kutykulę z sekcji tkanek.
- Delikatnie nanieś pipetą 50 μl 2,5% trypsyny bezpośrednio na sekcje tkanek i inkubuj przez 5-30 sekund w temperaturze pokojowej. [Krok krytyczny: Krok ten może wymagać optymalizacji. Czas inkubacji zależy od mikrodissekowanej tkanki oraz grubości sekcji. Zbyt długa inkubacja może usunąć wszystko, w tym komórki będące przedmiotem zainteresowania, natomiast zbyt krótka inkubacja może być niewystarczająca do usunięcia kutykuli]
- Krótko wypłucz sekcje w stożkowatej probówce o pojemności 50 ml zawierającej RNAse-free ddH2O, aby usunąć trypsynę oraz słabo przylegające fragmenty kutykuli.
- Zanurzaj slajdy sekwencyjnie w każdym z pozostałych roztworów etanolu i ksylenu przez zalecany czas (Tabela 1), aby zakończyć proces odwodnienia.
- Po przejściu gradientu odwodnienia slajdy są krótko suszone pod łagodnym strumieniem powietrza przez 60-120 sekund w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do LCM. [Uwaga: Przed wykonaniem LCM całkowicie usuń ksylen z sekcji tkanek. Ksylen rozpuszcza polimer kapsułki LCM, co prowadzi do niepowodzenia mikrodissekcji].
| 70% etanol (utrwalacz) | od 3 do 10 sekund |
| ddH2O2O | 5–10 sekund |
| Inkubacja z 2,5% trypsyną | 5–30 sekund |
| ddH2O2O | Od 5 do 10 sekund |
| 70% etanol | 60 sekund |
| 95% etanol | 60 sekundów |
| 10% etanol | 120 sekundów |
| 10% etanol | 120 sekund |
| Ksylen 10% | 120 sekund |
| Ksylen 10% | 120 sekund |
| Suszyć na powietrzu w łagodnym strumieniu powietrza | 60–120 sekund |
Tabela 1: Zalecana procedura odwadniania mrożonych przekrojów tkanki larwalnej do LCM.
3. Laserowa mikrodysekcja uchwycona
Do przeprowadzenia LCM wykorzystano instrument PixCell IIe LCM wyposażony w optykę epifluorescencyjną Fluor 30 zoptymalizowaną pod kątem EGFP.
[Kluczowy krok: Jeśli to możliwe, należy przeprowadzić mikrodysekcję w pomieszczeniu z kontrolowaną wilgotnością, aby zapobiec spadkowi wydajności mikrodysekcji spowodowanemu niewłaściwą wilgotnością powietrza. Wilgotność w pomieszczeniu jest krytycznym czynnikiem wpływającym na wydajność mikrodysekcji. Niska wilgotność może prowadzić do zwiększenia przyciągania elektrostatycznego, co skutkuje niespecyficznym wychwytem, natomiast wysoka wilgotność może obniżyć wydajność mikrodysekcji. Optymalną wydajność LCM osiągnięto przy względnej wilgotności powietrza w zakresie 25-50%.]
- Włącz zasilanie mikroskopu oraz modułu sterującego laserem.
- Załaduj uchwyt CapSure nasadkami HS LCM (Molecular Devices): jednorazowo można załadować dwa wkłady nasadek LCM.
- Uruchom oprogramowanie Molecular Devices i wprowadź szczegóły eksperymentu, w tym numer preparatu i numer partii nasadek.
- Załaduj nową nasadkę HS LCM z wkładu do urządzenia PixCell IIe LCM i ustaw ją prawidłowo względem dżojstika, aby zapewnić właściwe pozycjonowanie nasadki w stosunku do obszaru pobierania.
- Umieść na stole mikroskopu preparat zawierający świeżo odwodnione przekroje tkanek larwalnych do mikrosekcji.
- Zlokalizuj komórki znakowane fluorescencyjnie, korzystając z okularów lub ekranu komputera. Ze względu na wysoką specyficzność linii reporterowej transgenicznej ppk-GAL4,UAS-mCD8::GFP, neurony da klasy IV można łatwo zidentyfikować po fluorescencji GFP.
- Poddaj tkankę procedurze LCM przy użyciu nasadek CapSure HS LCM [szczegółowe instrukcje dotyczące konfiguracji urządzenia, ogniskowania lasera i przeprowadzania LCM znajdują się w referencji22].
- Dostosuj parametry impulsu laserowego „Power” (moc) i „Duration” (czas trwania), aby uzyskać precyzyjny punkt stopienia polimeru, którego rozmiar odpowiada wybranemu rozmiarowi plamki lasera. Dostosuj ustawienia, aby spersonalizować wielkość obszaru stopionego polimeru. Do mikrosekcji pojedynczych neuronów da klasy IV zastosowano następujące parametry: średnica plamki 7,5 μm, moc lasera 30-50 mW, czas trwania impulsu 2-4 ms oraz 1-2 wystrzały na komórkę. [Kluczowy krok: parametry lasera wymagane do uzyskania odpowiedniej plamki mogą różnić się w zależności od grubości tkanki i wilgotności powietrza w pomieszczeniu. Dostosuj ustawienia „Power” i „Duration”, aby uzyskać wymaganą wielkość plamki stopionego polimeru do mikrosekcji pojedynczych lub wielu komórek.]
- Aby maksymalnie zwiększyć specyficzność, wykonuj mikrosekcję komórek przy minimalnym nakładaniu się obszarów i silnej fluorescencji. Każda nasadka jest w stanie pobrać liczne ciała komórek. [Kluczowy krok: Aby uniknąć degradacji RNA, ogranicz całkowity czas analizy, wliczając odwodnienie i mikrosekcję, do mniej niż 45 minut]
- Po pobraniu wszystkich interesujących komórek, zdejmij nasadkę HS LCM z pobranymi komórkami i umieść ją na czystym szkiełku, aby potwierdzić obecność przechwyconych komórek oraz wizualnie sprawdzić nasadkę pod kątem obecności niepożądanych komórek lub zanieczyszczeń.
4. Izolacja RNA z komórek uzyskanych metodą LCM
- Przymocuj nakrętkę zawierającą mikrodissekowane komórki do urządzenia ExtracSure (Molecular Devices). Dodaj 12μl buforu do ekstrakcji RNA (PicoPure, Molecular Devices) na powierzchnię nakrętki z komórkami i połącz odwróconą cienkościenną probówkę reakcyjną (GeneAmp, Applied Biosystems) z urządzeniem ExtracSure. Umieść zestaw na tacy dopasowawczej (Molecular Devices) i przykryj go blokiem inkubacyjnym (Molecular Devices) uprzednio podgrzanym do 42°C w inkubatorze.
- Po 30-minutowej inkubacji odwiruj probówki zawierające ekstrakty przy 80 (x) g przez 2 minuty. Zamknij probówki i przechowuj ekstrakty komórkowe w temperaturze -80°C do momentu rozpoczęcia oczyszczania RNA.
MOMENT PRZERWY
- Wyekstrahować i oczyścić RNA metodą kolumnową zgodnie z instrukcją zestawu do ekstrakcji RNA PicoPure (Molecular Devices). Traktowanie DNAzą jest opcjonalne i w razie potrzeby może zostać przeprowadzone na kolumnie podczas oczyszczania RNA. Jeśli jest to wymagane, w celu zwiększenia końcowej wydajności RNA, podczas oczyszczania w jednej kolumnie można połączyć wiele próbek LCM, a następnie eluować je w małej objętości (1-30 μl) buforu do elucji (PicoPure, Molecular Devices) i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia. W razie potrzeby można pobrać alikwot 1 μl w celu oceny jakości całkowitego RNA za pomocą Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.).
Reprezentatywne wyniki
Mikrosekcja laserowa (LCM) została wykorzystana do izolacji pojedynczych, specyficznych dla danej klasy lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium (Rycina 1). LCM zapewnia wysoki stopień precyzji i swoistości podczas izolacji ciał komórkowych neuronów da Drosophila (Rycina 2a-c). Ponadto stwierdzono, że całkowite RNA oczyszczone z tych izolowanych neuronów da jest doskonałej jakości, co potwierdzono poprzez obecność wyraźnych pików rybosomalnego RNA 5,8S, 18S i 28S podczas analizy na Bioanalizatorze Agilent 210 (Agilent Technologies, Inc.) (Rycina 2d).
Aby ocenić stopień wzbogacenia wyizolowanych komórek pod kątem neuronalnym, przeprowadzono ilościową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) z użyciem markera specyficznego dla genów neuronalnych, elav. W analizach qRT-PCR obliczono względne poziomy ekspresji elav w mikrodysekcyjnie wydzielonych za pomocą LCM neuronach da, normalizując tę ekspresję względem endogennej kontroli (rp49) oraz w stosunku do całkowitego RNA wyizolowanego z całych larw przy użyciu metody ΔΔCt23. Analizy te wykazały ponad 2,5-krotne wzbogacenie względnych poziomów elav w próbkach neuronów da mikrodysekcyjnie wydzielonych za pomocą LCM w porównaniu z całymi zwierzętami (Rycina 3).
Rysunek 1: LCM z Muszka owocowa neurony obwodowe. (a) Wybiera się larwy trzeciego stadium o tym samym wieku, następnie przemywa je i (b) osadzone w formie do kriotomii z zastosowaniem związku OCT i zamrożone w temperaturze -80°C, (c) 8μm seryjne przekroje tkanek przygotowuje się przy użyciu standardowego kriotomatu i (d) rozłożono równomiernie na czystych szkiełkach przedmiotowych. Szkiełka z przytwierdzonymi skrawkami tkanek przechowywano w temperaturze -80°C przed przeprowadzeniem mikrodissekcji laserowej (LCM). (e,f) Bezpośrednio przed mikrosekcją laserową (LCM) skrawki tkanek należy rozmrozić i krótko utrwalić w 70% etanolu, a następnie krótko wypłukać w podwójnie destylowanej wodzie (ddH₂O).2O. (g) Preparaty na szkiełkach poddaje się krótkiej inkubacji z trypsyną, a następnie płucze wodą ddH.2Aby usunąć kutykule (czarne) z przekrojów larwalnych. (h,i) przekroje tkanek pozbawione kutykuli larwalnej są następnie poddawane dalszemu odwodnieniu w gradiencie etanolu, a na koniec przejaśniane w ksylenoli. (j) Nakładkę LCM z polimerem termolabilnym umieszcza się na skrawku tkanki, a następnie emituje impuls lasera na wybrany fluorescencyjne ciało komórki. Impuls lasera topi polimer, który następnie otacza wybrane ciało komórki. Nakładka polimerowa wraz z przechwyconym ciałem komórki zostaje uniesiona, a (k) Do komórki dodaje się bufor do ekstrakcji RNA. Uchwyconą komórkę wraz z buforem do ekstrakcji RNA inkubuje się w 42°C przez 30 minut i mogą być przechowywane w temperaturze -80°Club bezpośrednio poddane procesowi oczyszczania RNA.
Rycina 2: LCM umożliwia wysokoprecyzyjne wyizolowanie neuronów dopaminergicznych (da). (a) Reprezentatywny obraz odwodnionego i traktowanego trypsyną 8-mikronowego przekroju tkanki przed wykonaniem LCM, przedstawiający dwa neurony dopaminergiczne klasy IV znakowane GFP przez ppk-GAL4,UASmCD8::GFP szczep reporterowy. Uwaga: jeden z neuronów został zaznaczony (grot strzałki) w celu przechwycenia obrazu. (b) Ciało komórkowe zaznaczonego neuronu (grot strzałki) zostaje precyzyjnie wypreparowane metodą mikrodyssekcji z wysoką specyficznością z przekroju tkanki. (c) Widok czołowy pojedynczego neuronu da klasy IV uchwyconego na nakładce LCM. (d) Elektroforegram całkowitego RNA wyizolowanego z neuronów dopaminergicznych (da) uzyskanych metodą LCM, wykonany za pomocą systemu Agilent 210 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.), wykazujący doskonałą jakość RNA, na co wskazuje obecność ostrych piko rRNA 5,8S, 18S i 28S.
Rycina 3: qRT-PCR wykazuje znaczne wzbogacenie ekspresji genu markera neuronalnego w neuronach da wychwyconych metodą LCM w porównaniu z całym organizmem. Analizy qRT-PCR ekspresji genów markerów specyficznych dla neuronów (elav) w neuronach dopaminergicznych pobranych metodą LCM (21-7-GAL4,UAS-mCD8::GFP) a całe organizmy w przypadku larw trzeciego stadium o tym samym wieku badano w trzech powtórzeniach. Względne poziomy elav ekspresję w neuronach dopaminergicznych wyizolowanych za pomocą LCM znormalizowano względem kontroli endogennej (rp49) or w stosunku do całych larw z wykorzystaniem metody ΔΔCt232,5-krotny wzrost poziomu względnego elav W próbkach neuronów dopaminergicznych wyizolowanych metodą LCM zaobserwowano zmiany w stosunku do całych zwierząt.
Rozwiązywanie problemów
Problem: RNA uległo degradacji lub jest niskiej jakości.
W trakcie całego eksperymentu należy zapewnić warunki wolne od RNaz. Należy dążyć do skrócenia czasu przeprowadzania LCM na jeden preparat do 30 minut. Preparaty i próbki należy przechowywać na suchym lodzie, z wyjątkiem czasu wykonywania LCM. Należy unikać rozmrażania skrawków tkanek po ich wycięciu.
Problem: Większość komórek zostaje utracona z preparatu podczas traktowania trypsyną (krok 17-18).
Należy spróbować skrócić czas trawienia trypsyną. Należy spróbować zmniejszyć stężenie trypsyny.
Problem: Obecność kutykuli oraz innych niespecyficznych resztek tkanek na polimerze czepka.
Spróbuj usunąć resztki tkanki, przykładając lepką stronę karteczki samoprzylepnej do powierzchni polimeru2.
Problem: Niska wydajność LCM.
Spróbuj zwiększyć czas inkubacji w 10% etanolu i ksylenach. Zmniejsz wilgotność w pomieszczeniu, korzystając z osuszaczy powietrza.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół opisuje naszą zoptymalizowaną metodę izolacji neuronów obwodowych Drosophila za pomocą LCM. Choć ten protokół LCM został opracowany do specyficznej izolacji pojedynczych, klasowo specyficznych lub wielu neuronów da Drosophila z trzeciego stadium larwalnego rozwoju, niewielkie modyfikacje procedury mogą zostać łatwo dostosowane do pobierania innych typów komórek Drosophila ze wszystkich etapów rozwoju, przy użyciu odrębnych transgenów raportujących GAL4,UAS-mCD8-...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr. Yuh-Nung Janowi oraz dr. Wesowi Grueberowi za udostępnienie szczepów muszek wykorzystanych w niniejszym badaniu, a także Virginii Espinie, dr. Emanuelowi Petricoinowi i dr. Lance'owi Liottie za pomoc w przeprowadzeniu LCM. Autorzy dziękują Thomas F. and Kate Miller Jeffress Memorial Trust za wsparcie niniejszych badań (D.N.C.) oraz Biuru Prorektora George Mason University (E.P.R.I.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10X roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS) | MP Biomedicals | PBS10X02 | Rozcieńczony do 1X roztworu roboczego |
| 2,5% trypsyny | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | |
| Ksyleny, stopień histologiczny | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| woda wolna od RNaz | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| związek OCT (Optimal Cutting Temperature) | Tissue-Tek | 4583 | |
| Zestaw do izolacji RNA PicoPure | Molecular Devices | KIT0204 | Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta’instrukcje |
| Cienkościenna probówka reakcyjna z kopułkową zakrętką | Applied Biosystems | N8010611 | |
| Urządzenie do ekstrakcji próbek ExtracSure | Molecular Devices | LCM 0208 | |
| Blok inkubacyjny do ekstrakcji próbek z kapsułek CapSure HS | Molecular Devices | LCM0505 | |
| Kasetka do pozycjonowania nakładek CapSure HS LCM oraz urządzeń do ekstrakcji próbek ExtracSure | Molecular Devices | LCM0504 | |
| nakrętki CapSure HS LCM | Molecular Devices | LCM0213 | |
| szkiełka przedmiotowe 75x100 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Formy do zatapiania tkanek | Fisher Scientific | NC9642669 | |
| Tłuczek polipropylenowy do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml | USA Scientific, Inc. | 1415-5390 | |
| 70% etanol; 95% etanol; 100% etanol | |||
| Suchy lód | |||
Sprzęt:
|
Bibliografia
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
- Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
- Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
- Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
- Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
- Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
- Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
- Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
- Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
- Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
- Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
- Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
