Izolacja, hodowla i analiza migracji ludzkich limfocytów T in vitro

Podsumowanie

Migracja limfocytów T zachodzi podczas homingu do organów limfatycznych, opuszczania naczyń krwionośnych i wnikania do tkanek obwodowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który może być wykorzystany do analizy migracji limfocytów T in vitro.

Streszczenie

Migracja limfocytów T obejmuje interakcje adhezyjne integryn powierzchniowych komórki z ligandami ekspresjonowanymi na innych komórkach lub z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. Precyzyjna aktywacja czasowo-przestrzenna integryn z stanu o niskim powinowactwie do stanu o wysokim powinowactwie na przednim brzegu komórki jest istotna dla migracji limfocytów T¹Podobnie, retrakcja tylnej krawędzi komórki, czyli uropodu, jest niezbędnym etapem w utrzymaniu stałej, zależnej od integryn ruchliwości limfocytów T²Wiele podejść terapeutycznych w chorobach autoimmunologicznych lub zapalnych celuje w integryny w celu zahamowania nadmiernej rekrutacji i migracji leukocytów³. Aby zbadać zdarzenia molekularne regulujące migrację ludzkich limfocytów T, wykorzystaliśmy układin vitrosystem do analizy migracji komórek na podłożu dwuwymiarowym, które naśladuje środowisko, z jakim limfocyt T styka się podczas rekrutacji z naczyń krwionośnych. Limfocyty T są najpierw izolowane od ludzkich dawców, a następnie stymulowane i hodowane przez siedem do dziesięciu dni. Podczas testu limfocyty T mogą przylegać i migrować na podłożu pokrytym cząsteczką adhezji międzykomórkowej 1 (ICAM-1), która jest ligandem dla integryny LFA-1, oraz czynnikiem pochodzącym z komórek zrębu 1 (SDF-1). Nasze dane pokazują, że limfocyty T wykazują prędkość migracji wynoszącą ~15 μm/min. Migrację limfocytów T można zahamować poprzez blokadę integryn¹lub za pomocą inhibitorów komórkowego aparatu akto-miozynowego regulującego migrację komórek²Empty source HTML. No content to translate.

Protokół

1. Izolacja ludzkich limfocytów T

1. Pobrać krew ludzką od zdrowego dawcy. Przed przejściem do następnego etapu odczekać, aż krew osiągnie temperaturę pokojową (~30 min).
2. Do 8 mL polistyrenowej probówki z zaokrąglonym dnem delikatnie nalać 3 mL medium do gradientu gęstości Polymorph o temperaturze pokojowej. Na wierzch medium Polymorph delikatnie nalać 3 mL krwi pełnej. Ważne jest, aby uniknąć wymieszania obu odczynników.
3. Wirować probówki z prędkością 500 x g przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
4. Po wirowaniu mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) oddzieliły się od pozostałych składników krwi, tworząc górną warstwę komórkową. Warstwa PBMC widoczna jest jako pierwszy mętny prążek, licząc od góry.
5. Ostrożnie usunąć przejrzystą, żółtą fazę górną krwi znajdującą się nad warstwą PBMC, a następnie za pomocą mikropipety P1000 przenieść warstwę PBMC do stożkowej probówki o pojemności 15 mL lub 50 mL.
6. Przemyć PBMC dwukrotnie roztworem PBS, wirować komórki z prędkością 500 x g przez 5 minut podczas każdego etapu. Nadkrawkowa ciecz po każdym przemyciu będzie lekko mętna.

2. Hodowla ludzkich limfocytów T

1. Za pomocą pipety przenieść PBMC do kolby hodowlanej T-75 zawierającej 20 mL pożywki RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 1 μg/mL fitohemaglutyniny (PHA).
2. Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez co najmniej 1 godzinę, maksymalnie do 24 godzin. Ten etap pozwala na oddzielenie monocytów, które przylegają do powierzchni kolby, od limfocytów pozostających w zawiesinie. W przypadku zastosowania krótkiej inkubacji (1 godzina) na tym etapie, dopuszczalne jest użycie pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny bez dodatku PHA określonego w kroku 2.1.
3. Ostrożnie usunąć całą pożywkę z kolby, przenieść ją do stożkowej probówki 50 mL i wirować przy 500 x g przez 5 minut.
4. Resuspender osad komórkowy, który składa się obecnie głównie z limfocytów, i przenieść komórki do nowej kolby T-75 zawierającej 25 mL pożywki RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 1 μg/mL PHA.
5. Inkubować w temperaturze 37°C przez 3 dni (2 dni, jeśli początkowa inkubacja PBMC trwała całą noc). Po 24 godzinach wzrostu może być konieczne dodanie 15-20 mL świeżej pożywki i przeniesienie hodowli do większej kolby T-175.
6. Po 3 dniach za pomocą pipety usunąć pożywkę wraz z zawiesiną limfocytów z kolby i przenieść je do stożkowej probówki 50 mL. Wirować przy 500 x g przez 5 minut.
7. Resuspender osad komórkowy i przenieść komórki do nowej kolby T-75 lub T-175 zawierającej odpowiednio 25 mL (T-75) lub 50 mL (T-175) pożywki RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 20 ng/mL ludzkiej IL-2 lub IL-15.
8. Hodować limfocyty przez 4-7 dni. W przypadku rozpoczęcia hodowli w kolbie T-75, po 1-2 dniach konieczne będzie rozszerzenie hodowli i przeniesienie jej do kolby T-175.

3. Test migracji limfocytów in vitro

1. Na jeden dzień przed testem migracji pokryć szalkę z szklanym dnem 0,17 mm 20 μg/mL Protein A lub G w PBS, inkubując przez noc w temperaturze 4°C.
2. Szalkę dokładnie przemyć PBS.
3. Unieruchomić ludzkie ICAM-1/Fc (10 μg/mL) oraz ludzkie SDF-1 (2 μg/mL), dodając te odczynniki w roztworze PBS do szalki i inkubując przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Przygotować limfocyty T, najpierw określając gęstość komórek w hodowli w kolbie T-175 za pomocą hemacytometru. Aby uzyskać gęstość komórek odpowiednią do analizy migracji, na jedną szalkę należy użyć około 2-5 x 10⁵ komórek.
5. Limfocyty T przemyć dwukrotnie PBS, a następnie resuspender w 1 mL pożywki L-15 zawierającej 1 mg/mL D-glukozy.
6. Szalkę pokrytą ICAM-1/Fc i SDF-1 dokładnie przemyć PBS.
7. Przenieść limfocyty T w 1 mL pożywki do szalki i utrzymywać je w temperaturze 37°C.

4. Rejestrowanie sekwencji obrazów za pomocą oprogramowania NIS Elements

1. Otwórz oprogramowanie NIS Elements.
2. W menu ustawień kamery wybierz „2x2 binning” jako tryb zarówno dla obrazowania na żywo, jak i dla rejestracji obrazów.
3. Przejdź do menu Applications i wybierz Define/Run Experiment.
4. Określ odstępy czasowe między obrazami oraz całkowity czas trwania sekwencji rejestracji obrazów.
5. Naciśnij przycisk „Run”, aby rozpocząć akwizycję obrazów.
6. Komórki można śledzić, a parametry migracji (prędkość, długość ścieżki, przemieszczenie itp.) kwantyfikować przy użyciu jednego z kilku pakietów oprogramowania, takich jak ImageJ, AutoQuant lub Volocity (Rysunek 1).
7. Aby wygenerować wykres typu „spider web plot”, zbiera się współrzędne x-y dla każdej komórki i punktu czasowego (Rysunek 2), a następnie rzutuje się je na wykres ze wspólnym punktem startowym dla każdej komórki w początku układu współrzędnych (Rysunek 3).

5. Reprezentatywne wyniki

W 6. dniu hodowli w obecności IL-2 lub IL-15 limfocyty T stanowią >98% komórek, co określono na podstawie pozytywnego barwienia na CD3 oraz pozytywnego barwienia na CD4 i/lub CD8. W przypadku IL-2 stwierdzono obecność 83% komórek CD4+, 15% CD8+ oraz <1% komórek CD4+CD8+. W przypadku IL-15 stwierdzono obecność 88% komórek CD4+, 11% CD8+ oraz <1% komórek CD4+CD8+. Podczas migracji limfocytów T na podłożach ICAM-1/SDF-1 komórki wykazywały prędkość wynoszącą około 15 μm/min, która może być utrzymana przez 1 godzinę. Migracja limfocytów T na ICAM-1/SDF-1 jest zależna od adhezji zapośredniczonej przez LFA-1, ponieważ przeciwciało blokujące ligand LFA-1 silnie hamuje migrację.

Rysunek 1. Śledzenie ruchu migrujących limfocytów T. Limfocyty T wyizolowane z krwi pełnej i hodowane w obecności IL-2 lub IL-15 przez 6 dni poddano adhezji i migracji na szalkach z szklanym dnem pokrytych 10 μg/mL ICAM-1 oraz 2 μg/mL SDF-1. Obrazy pozyskiwano co 10 sekund przez 30 minut. Komórki identyfikowano na każdym obrazie i śledzono w czasie za pomocą oprogramowania Volocity. Film ten przedstawia losową migrację limfocytów T z prędkością ~15 μm/min.

Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.
Film 1. Śledzenie komórek migrujących limfocytów T. Limfocyty T wyizolowane z krwi pełnej i hodowane w obecności IL-2 lub IL-15 przez 6 dni poddano adhezji i migracji na szalkach z szklanym dnem pokrytych 10 μg/mL ICAM-1 i 2 μg/mL SDF-1. Obrazy pozyskiwano co 10 sekund przez 30 minut. Komórki identyfikowano na każdym obrazie i śledzono w czasie za pomocą oprogramowania Volocity. Film ten przedstawia losową migrację limfocytów T z prędkością ~15 μm/min.

Rycina 2. Spacjoczasowa pozycja komórek. Współrzędne X-Y każdej komórki zostały uzyskane dla każdego punktu czasowego przy użyciu oprogramowania Volocity.

Rycina 3. „Wykres pajęczyny”. Wykorzystując współrzędne X-Y-t dla każdej komórki, wybrano losowo 15 komórek i naniesiono je na wykres ze wspólnym punktem startowym w początku układu współrzędnych. Porównanie wykresów pajęczyn daje szybki wizualny obraz różnic w migracji pomiędzy różnymi warunkami eksperymentalnymi. Wykresy migracji limfocytów T w warunkach kontrolnych (panel lewy) oraz w obecności blokującego ligand przeciwciała anty-LFA-1 (panel prawy).

Dyskusja

W tym doświadczeniu przedstawiamy szczegóły prostego systemu służącego do analizy motywności pierwotnych ludzkich limfocytów T. Testy migracji in vitro są wykorzystywane do badania roli wielu cząsteczek i szlaków sygnałowych zaangażowanych w lokomocję różnych typów komórek. Projektując własne doświadczenie na podstawie naszego protokołu, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych kontroli, takich jak: 1) powłoki podłoża nieprzyczepne lub nieprzyczepne poprzez integryny, odpowiednio: albuminy surowicy bydlęcej (BSA)...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
Penicylina-Streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical & Scientific Corporation	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
Rekombinowana ludzka IL-2	R&D Systems	202-IL
Rekombinowana ludzka IL-15	R&D Systems	247-IL
Białko G	Sigma-Aldrich	19459
Rekombinowana ludzka ICAM-1/Fc	R&D Systems	720-IC
Rekombinowana ludzka SDF-1	R&D Systems	350-NS