Izolacja ludzkich limfocytów T, hodowla i analiza migracji in vitro

Podsumowanie

T zachodzi podczas naprowadzania do narządów limfatycznych, wyjścia z układu krwionośnego i wnikania do tkanek obwodowych. W tym miejscu opisujemy protokół, który można wykorzystać do analizy migracji limfocytów T in vitro.

Streszczenie

Migracja limfocytów T polega na adhezyjnym oddziaływaniu integryn powierzchniowych komórek z ligandami ulegającymi ekspresji na innych komórkach lub z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. Precyzyjna czasoprzestrzenna aktywacja integryn ze stanu niskiego powinowactwa do stanu wysokiego powinowactwa na krawędzi natarcia komórki jest ważna dla migracji limfocytów T ¹. Podobnie, retrakcja krawędzi spływu komórek lub uropoda jest niezbędnym krokiem w utrzymaniu trwałej, zależnej od integryny ruchliwości limfocytów T ². Wiele podejść terapeutycznych do chorób autoimmunologicznych lub zapalnych jest ukierunkowanych na integryny jako środek hamujący nadmierną rekrutację i migrację leukocytów ³. Aby zbadać zdarzenia molekularne, które regulują migrację ludzkich limfocytów T, wykorzystaliśmy system in vitro do analizy migracji komórek na dwuwymiarowym podłożu, który naśladuje środowisko, z którym limfocyt T spotyka się podczas rekrutacji z układu krwionośnego. Limfocyty T są najpierw izolowane od ludzkich dawców, a następnie stymulowane i hodowane przez siedem do dziesięciu dni. Podczas testu limfocyty T mogą przylegać i migrować na podłożu pokrytym cząsteczką adhezji międzykomórkowej-1 (ICAM-1), ligandem integryny LFA-1 i czynnikiem pochodzącym z komórek zrębowych-1 (SDF-1). Nasze dane pokazują, że limfocyty T wykazują prędkość migracji ~15 μm/min. Migracja limfocytów T może być hamowana przez blokadę integryny ¹ lub przez inhibitory komórkowej maszynerii aktomiozyny, która reguluje migrację komórek ².

Protokół

1. Izolacja ludzkich limfocytów T

1. Pozyskaj ludzką krew od zdrowego dawcy. Pozwól krwi ostygnąć do temperatury pokojowej (~30 min) przed przejściem do następnego kroku.
2. Delikatnie odpipetować 3 ml pożywki o gradientzie gęstości polimorficznej o temperaturze pokojowej do probówki z polistyrenu o pojemności 8 ml. Delikatnie dodaj 3 ml krwi pełnej na wierzch pożywki Polymorph. Ważne jest, aby unikać mieszania tych dwóch odczynników.
3. Odwirować probówki o sile 500 x g przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
4. Po odwirowaniu komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) oddzieliły się od innych składników krwi do górnej warstwy komórkowej. Warstwa PBMC pojawia się, od góry do dołu, jako pierwsze pasmo zachmurzenia.
5. Ostrożnie usunąć przezroczystą górną fazę krwi o żółtym zabarwieniu, powyżej warstwy PBMC, a następnie za pomocą mikropipety P1000 przenieść warstwę PBMC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml.
6. Przemyć PBMC dwukrotnie PBS, odwirowując komórki przy 500 x g przez 5 minut za każdym razem. Supernatant będzie nieco mętny po każdym praniu.

2. Hodowla ludzkich limfocytów T

1. Za pomocą pipety przenieś PBMC do kolby hodowlanej T-75 w 20 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1 μg/ml fitohemaglutyniny (PHA).
2. Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez co najmniej 1 godzinę do 24 godzin. Ten krok pozwala na oddzielenie monocytów, które będą przylegać do powierzchni kolby, od limfocytów, które pozostają w zawiesinie. Jeżeli na tym etapie stosuje się krótką inkubację (1 godzina), dopuszczalne jest użycie pożywek RPMI 1640 zawierających 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny bez suplementacji PHA, jak określono w kroku 2.1.
3. Ostrożnie wyjąć wszystkie podłoża z kolby, dodać je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 500 x g przez 5 minut.
4. Ponownie zawiesić osad komórkowy, który teraz zawiera głównie limfocyty, i przenieść komórki do nowej kolby T-75 zawierającej 25 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1 μg/ml PHA.
5. Inkubować w temperaturze 37°C przez 3 dni (2 dni, jeśli początkowa inkubacja PBMC trwała przez noc). Po 24 godzinach wzrostu może być konieczne dodanie 15-20 ml świeżej pożywki i przeniesienie do większej kolby T-175.
6. Po 3 dniach za pomocą pipety usunąć pożywkę i zawieszone limfocyty z kolby i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 500 x g przez 5 minut.
7. Zawiesić osad komórkowy i przenieść komórki do nowej kolby T-75 lub T-175 zawierającej 25 ml (T-75) lub 50 ml (T-175) RPMI 1640 z 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 20 ng/ml ludzkiej IL-2 lub IL-15.
8. Hoduj limfocyty przez 4-7 dni. Jeśli zaczynasz od kolby T-75, kultura będzie musiała zostać rozszerzona i przeniesiona do kolby T-175 po 1-2 dniach.

3. Test migracji limfocytów in vitro

1. Na 1 dzień przed testem migracji pokryć naczynie o średnicy 0,17 mm ze szklanym dnem 20 μg/ml białka A lub G w PBS przez noc w temperaturze 4°C.
2. Dokładnie umyj naczynie za pomocą PBS.
3. Unieruchomić ludzkie ICAM-1/Fc (10 μg/ml) i ludzkie SDF-1 (2 μg/ml) poprzez dodanie tych odczynników do roztworu PBS do naczynia i inkubację przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Przygotować limfocyty T, najpierw określając gęstość komórek w kulturze w kolbie T-175 za pomocą hemacytometru. Na każde naczynie należy użyć około 2-5 x 10⁵ komórek, aby uzyskać gęstość komórek odpowiednią do analizy migracji.
5. Przemyć limfocyty T dwukrotnie PBS, a następnie ponownie zawiesić w 1 ml pożywki L-15 zawierającej 1 mg/ml D-glukozy.
6. Naczynie pokryte ICAM-1/Fc i SDF-1 dokładnie umyć za pomocą PBS.
7. Przenieś limfocyty T z pożywki o objętości 1 ml do naczynia i utrzymuj je w temperaturze 37°C.

4. Przechwytywanie sekwencji obrazów za pomocą oprogramowania NIS Elements

1. Otwórz oprogramowanie NIS Elements.
2. W menu ustawień aparatu wybierz "Binning 2x2" jako tryb zarówno obrazowania na żywo, jak i przechwytywania obrazu.
3. Przejdź do menu Aplikacje i wybierz opcję Definiuj/Uruchom eksperyment.
4. Wybierz czas między obrazami i całkowitą długość sekwencji przechwytywania obrazu.
5. Naciśnij przycisk "Uruchom", aby rozpocząć pobieranie obrazu.
6. Komórki można śledzić, a parametry migracji (prędkość, długość ścieżki, przemieszczenie itp.) określać ilościowo za pomocą jednego z kilku pakietów oprogramowania, w tym ImageJ, AutoQuant lub Volocity (rysunek 1).
7. Aby wygenerować "wykres pajęczyny", współrzędne x-y dla każdej komórki i punktu czasowego są zbierane (rysunek 2) i rzutowane na wykres ze wspólnym punktem początkowym dla każdej komórki w punkcie początkowym (rysunek 3).

5. Reprezentatywne wyniki

W 6 dniu hodowli w obecności IL-2 lub IL-15, limfocyty T stanowią >98% komórek, co zostało określone przez pozytywne barwienie CD3, jak również dodatnie barwienie CD4 i/lub CD8. W przypadku IL-2 znaleźliśmy 83% komórek CD4 +, 15% komórek CD8 + i <1% komórek CD4 + CD8 +. W przypadku IL-15 znaleźliśmy 88% komórek CD4 +, 11% komórek CD8 + i <1% komórek CD4 + CD8 +. Podczas migracji limfocytów T na substratach ICAM-1/SDF-1 komórki wykazywały prędkość około 15 μm/min, która może być utrzymywana przez 1 godzinę. Migracja limfocytów T na ICAM-1/SDF-1 jest zależna od adhezji za pośrednictwem LFA-1, ponieważ przeciwciało blokujące ligand anty-LFA-1 poważnie hamuje migrację.

Rysunek 1. Śledzenie komórek migrujących limfocytów T. Limfocyty T wyizolowane z krwi pełnej i hodowane w obecności IL-2 lub IL-15 przez 6 dni pozwolono na przyleganie i migrację na naczyniach ze szklanym dnem pokrytych 10 μg/ml ICAM-1 i 2 μg/ml SDF-1. Obrazy były rejestrowane co 10 sekund przez 30 minut. Komórki zostały zidentyfikowane na każdym obrazie i śledzone w czasie za pomocą oprogramowania Volocity. Ten film pokazuje losową migrację limfocytów T z prędkością ~15 μm/min.

Kliknij tutaj, aby zobaczyć film.
Film 1. Śledzenie komórek migrujących limfocytów T. Limfocyty T wyizolowane z krwi pełnej i hodowane w obecności IL-2 lub IL-15 przez 6 dni pozwolono na przyleganie i migrację na naczyniach ze szklanym dnem pokrytych 10 μg/ml ICAM-1 i 2 μg/ml SDF-1. Obrazy były rejestrowane co 10 sekund przez 30 minut. Komórki zostały zidentyfikowane na każdym obrazie i śledzone w czasie za pomocą oprogramowania Volocity. Ten film pokazuje losową migrację limfocytów T z prędkością ~15 μm/min.

Rysunek 2. Czasoprzestrzenne położenie komórki. Współrzędne X-Y każdej komórki uzyskano dla każdego punktu czasowego za pomocą oprogramowania Volocity.

Rysunek 3. "Fabuła pajęczej sieci". Korzystając ze współrzędnych X-Y-t dla każdej komórki, wybrano losowo 15 komórek i wykreślono je ze wspólnym punktem początkowym w punkcie początkowym. Porównanie wykresów pajęczyn daje szybki wizualny obraz różnic w migracji między różnymi warunkami eksperymentalnymi. Wykresy migracji limfocytów T w warunkach kontrolnych (lewy panel) i w obecności przeciwciała blokującego ligand anty-LFA-1 (prawy panel).

Dyskusja

W tym eksperymencie podajemy szczegółowe informacje na temat prostego systemu do analizy ruchliwości pierwotnych ludzkich limfocytów T. Testy migracji in vitro zostały wykorzystane do zbadania ról wielu cząsteczek i szlaków sygnałowych zaangażowanych w poruszanie się różnych typów komórek. Niektóre krytyczne kontrole, o których należy pamiętać podczas projektowania własnego eksperymentu na podstawie naszego protokołu, obejmują: 1) Nieadhezyjne lub nieintegrynowe adhezyjne powłoki podłoża, takie jak odpowiednio a...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI 1640	GIBCO, firmy Life Technologies	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
Penicylina-Streptomycyna	GIBCO, firmy Life Technologies	15140
1-stopniowe polimorfy	Dokładna chemia i Korporacja Naukowa	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
Rec. ludzki samolot IL-2	R& D Systems	202-IL
Rec. człowiek IL-15	R& D Systems	247-IL
Białko G	Sigma-Aldrich	19459
Rec. ludzki ICAM-1/Fc	R& D Systems	720-IC
Rec. człowiek SDF-1	R& D Systems	350-NS