Test chwytania zdobyczy: metoda badania zachowania larw danio pręgowanego podczas chwytania zdobyczy

Streszczenie

Źródło: Muto, A., et al. Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego. J. Vis. Exp.(2018)

Ten film opisuje test chwytania zdobyczy. Film omawia metodę badania zachowań larw danio pręgowanego podczas chwytania zdobyczy po laserowej ablacji określonych neuronów.

Protokół

1. Ocena konsekwencji behawioralnych po ablacji laserowej

1. Skonfiguruj behawioralny system nagrywania, który składa się ze stereoskopu wyposażonego w kamerę wideo. Należy używać aparatu z odpowiednim oprogramowaniem do pozyskiwania obrazów, komercyjnym lub wykonanym na zamówienie (Rysunek 1A).
2. Zoptymalizuj warunki oświetleniowe, aby pantofelek mógł zostać wykryty przez przetwarzanie obrazu. Na przykład użyj pierścieniowej białej diody LED z elementem dystansowym (Rysunek 1B).
   Uwaga: Odległość od diody LED i kąt jej nachylenia wpływają na wygląd próbki (tj. jasny na ciemnym tle lub ciemny na jasnym tle) i dlatego mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego przetwarzania obrazu. Określ najlepszą wysokość podkładki dystansowej (Rysunek 1C).
3. Umieścić larwę danio pręgowanego (odzyskaną z eksperymentu z ablacją laserową opisanego w sekcji 1) w komorze rejestrującej zachowanie (która była przymocowana do szklanego szkiełka) z usuniętą oryginalną górną uszczelką (ryc. 1D).
4. Za pomocą mikropipety zebrać 50 pantofelków zawieszonych w wodzie ze zlewki i umieścić je w komorze rejestrującej.
5. Umieść szkiełko nakrywkowe na górze komory nagrywania. Umieść niewielką kroplę wody na szkiełku nakrywkowym przed umieszczeniem na powierzchni wody w komorze nagrywającej, aby uniknąć wprowadzania powietrza do komory.
   Uwaga: Na tym etapie część wody z pantofelkiem wyleje się z komory nagrywającej. Pozostała liczba pantofelków w komorze zapisu wyniesie około 30-40.
6. Umieścić komorę rejestracyjną (zawierającą larwę i pantofelek) w systemie oświetleniowym (rysunek 1D).
7. Rozpocznij nagrywanie poklatkowe z szybkością 10 kl./s przez 11 min (6 600 klatek).
8. (Opcjonalnie) Dla każdej larwy, która została przebadana pod kątem zachowania, obserwuj fluorescencję obszarów poddanych ablacji laserowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby potwierdzić skuteczność ablacji laserowej (tj. brak lub znacznie zmniejszoną liczbę komórek fluorescencyjnych w obszarze naświetlanym laserem).
   Uwaga: Nawet po napromieniowaniu niektóre komórki fluorescencyjne można nadal zaobserwować ze względu na późniejszy początek ekspresji genu Gal4 w komórkach, które różnicowały się po ablacji.
9. Po zarejestrowaniu zachowania larwy, aby zrekompensować brak jednolitości tła, wykonaj podział piksel po pikselu każdej klatki przez średni obraz na Fidżi: kliknij "Proces", "Kalkulator obrazu", "Operacja: Dziel", "32-bitowy (zmiennoprzecinkowy) wynik" i "OK". Aby utworzyć uśredniony obraz, kliknij "Obraz", "Stosy", "Projekt Z", "Średnia intensywność" i "OK" (Rysunek 1E, F).
10. Policz liczbę pantofelków pozostałych w komorze, klikając "Analizuj", "Analizuj cząstki", ustawiając zakres obszaru, który obejmuje wszystkie pantofelki, zaznaczając pole wyboru "Pokaż: Maski" i klikając "OK". Opcja "Pokaż:Maski" zapewni wyodrębniony obraz pantofelka (rysunek 1G) z listą liczby cząstek (paramecji) w każdej klatce.
11. Wykreśl liczbę pantofelków pozostałych w komorze zapisu w czasie. Ponieważ szacunki liczby pantofelków są zaszumione, zalecamy wykonanie średniej ruchomej dla każdego punktu w zakresie 600 klatek (1 minuta) w arkuszu kalkulacyjnym.

Wyniki

Rysunek 1. Test chwytania zdobyczy i reprezentatywne dane w larwach danio pręgowanego poddanych ablacji laserowej.(A) System rejestracji zachowań. Mikroskop stereoskopowy został wyposażony w kamerę CMOS. Obrazy zostały pozyskane za pomocą niestandardowego skryptu. (B) Części składowe systemu oświetleniowego. Papier w kolorze szarym, szklany dyfuzor, biała lampa pierścieniowa LED, dyfuzo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komory obrazowania	Grace Bio-Labs	Komory obrazowania CoverWell PCIA-2.5	Używany jako behawioralna komora nagraniowa
ORCA-Flash4.0	Fotonika Hamamatsu	Modelu:C11440-22CU	Naukowa kamera CMOS
SZX7	Olympus		Stereoskop
Pierścieniowe światło LED	Ccs	Modelu: LDR2-100SW2-LA	Biała dioda LED
Uszczelka komory hybrydyzacji Secure-Seal, 8 komór, średnica 9 mm x głębokość 0,8 mm	Sondy molekularne	Katalog # S-24732	Używany jako komora zapisowa w obrazowaniu Ca