$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Transfer biblioteki małych cząsteczek
Podczas gdy transfer złożony można zautomatyzować za pomocą metod transferu zrobotyzowanego, opiszemy metodę transferu ręcznego.
- Biblioteki małych cząsteczek są zwykle dostarczane w formacie 96-dołkowym, przy czym każdy związek jest przechowywany w DMSO jako zapas o pojemności 10 mM. Na około 60 minut przed osiągnięciem przez zarodki etapu, w którym mają zostać dodane związki, należy rozmrozić żądaną liczbę 96-dołkowych płytek zawierających porcje małych cząsteczek (płytka źródłowa). Zwróć uwagę na numer seryjny lub inny numer identyfikacyjny tabliczek źródłowych. Aby zminimalizować kondensację na płytkach, rozmrażanie może nastąpić w komorze osuszającej zawierającej Drierite (W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
- Krótko odwiruj płytki w wirówce stołowej wyposażonej w adapter płytki wielodołkowej.
- Usuń aluminiową taśmę uszczelniającą z płyty źródłowej. Za pomocą 12-kanałowej pipety rozcieńczyć związki w płytce źródłowej do stężenia 0,5 mM (na przykład, jeśli zaczynasz od 250 nL podwielokrotności 10 mM zapasu, dodaj 4,75 μl DMSO do każdego dołka).
- Gdy zarodki na płytce 96-dołkowej (płytce biorczej) osiągną pożądany etap, użyj 12-kanałowej pipety (2-20 μL), aby przenieść 2,5 μl związków (0,5 mM) z płytek źródłowych do płytek biorczych zawierających zarodki.
- Zapisać numer identyfikacyjny płytek źródłowych na płytkach zarodkowych biorcy. Przykryj płytki biorcze, na których znajdują się zarodki i związki chemiczne, przykryj pokrywkami, delikatnie wymieszaj płytki, delikatnie obracając, i umieść je w inkubatorze o temperaturze 28,5°C.
- Przykryj każdą płytkę źródłową zawierającą niewykorzystane małe cząsteczki (0,5 mM) aluminiową taśmą uszczelniającą i umieść w zamrażarce w temperaturze -80°C do długotrwałego przechowywania.
2. Badania przesiewowe pod kątem wpływu małych cząsteczek poprzez wizualną inspekcję fenotypów
- Przed wykonaniem screena sformułuj konkretne kryterium tego, co będzie stanowić "trafienie".
- W pożądanych momentach rozwoju należy wyjąć z inkubatora 96-dołkowe płytki zawierające zarodki poddane działaniu związków chemicznych i zbadać każdą studzienkę pod mikroskopem stereoskopowym. W celu lepszej wizualizacji subtelnych zmian, takich jak zmiany we wzorcu krążenia, można użyć mikroskopu odwróconego z kontrastem fazowym. Mikroskopia fluorescencyjna może być stosowana do badania zaburzeń ekspresji białek GFP lub DsRed pod swoistym tkankowo promotorem.
- Szybko zeskanuj 96-dołkowe płytki w poszukiwaniu dowolnego dołka, w którym co najmniej 3 z 5 zarodków wykazują przepisany fenotyp "trafienia". Zapisz tożsamość płytki i lokalizację studni każdego potencjalnego trafienia.
- Potwierdzić potencjalne trafienie, ponownie badając działanie związku w kilku dawkach (1 uM, 5 uM, 10 μM i 50 μM). Dla każdej dawki 10 zarodków bada się w 0,5 ml pożywki E3 w formacie 48-dołkowej płytki. Czas dodania związku do ponownego badania powinien być identyczny z terminem pierwotnego badania przesiewowego. Trafienie jest potwierdzone, gdy wywołany fenotyp jest odtwarzany przy ponownym badaniu związku
- Zidentyfikuj trafiony związek z bazy danych małych cząsteczek w bibliotece chemicznej.