1. Przygotowanie zarodków/larw
- Przenieś 100 zarodków na szalkę Petriego o średnicy 100 mm z 25 ml wody jajecznej. Przechowywać nie więcej niż 100 zarodków na szalce Petriego i hodować je w temperaturze 28 °C.
- Aby zahamować pigmentację, dodaj fenylotiomocznik (PTU) do szalek Petriego przed 10 godzinami po zapłodnieniu (hpf) i hoduj zarodki/larwy do 80 hpf. Końcowe stężenie PTU wynosi 0,2 mM.
UWAGA: PTU jest toksyczny. Stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.
- Znieczulić larwy poprzez dodanie estru etylowego kwasu 3-aminobenzoesowego (Trikaina) o końcowym stężeniu 0,016% do szalek Petriego. Następnie, za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, posortuj larwy CFP-dodatnie. Używaj larw o podobnej wielkości wątroby i odrzucaj te z mniejszą lub większą wątrobą.
UWAGA: można użyć dowolnych larw CFP-dodatnich, niezależnie od intensywności, ponieważ nie ma różnicy w zakresie ablacji hepatocytów między larwami hemizygotycznymi i homozygotycznymi.
UWAGA: trikaina jest toksyczna. Stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.
- Usuń wodę jajeczną zawierającą trikainę i dodaj wodę jajeczną uzupełnioną 0,2 mM PTU. Przechowywać zarodki/larwy w temperaturze 28 °C.
2. Leczenie Mtz
- Przygotować świeży roztwór 10 mM Mtz, rozpuszczając 0,171 g proszku Mtz w 100 ml wody jajecznej uzupełnionej 0,2% DMSO i 0,2 mM PTU. Aby całkowicie rozpuścić Mtz, wymieszaj roztwór w temperaturze pokojowej, szybko mieszając przez 20-30 minut. Aby pomóc w rozpuszczaniu Mtz i zwiększyć przenikanie Mtz do larw, dodaj DMSO podczas przygotowywania Mtz.
UWAGA: długotrwałe narażenie lub zwiększone stężenie Mtz jest toksyczne. Stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.
- Podzielić larwy na grupy kontrolne i eksperymentalne, przenosząc żądaną liczbę larw na dwie różne 100-milimetrowe szalki Petriego lub płytkę wielodołkową. W przypadku grupy doświadczalnej larwy należy przechowywać w roztworze o stężeniu 10 mM Mtz; w przypadku grupy kontrolnej trzymaj je w wodzie jajecznej zawierającej 0,2% DMSO.
- Przykryć płytki lub szalki Petriego zawierające roztwór Mtz folią aluminiową, aby zapobiec fotoinaktywacji Mtz, i inkubować w temperaturze 28 °C. Czas trwania leczenia Mtz zależy od stadium larwalnego i linii transgenicznej.
3. Analiza regeneracji wątroby pod wpływem dróg żółciowych
- Pod koniec okresu ablacji należy usunąć roztwór Mtz z płytek. Umyj larwy poddane działaniu Mtz, dodając 25 ml wody jajecznej. Zakręć płytką 2-3 razy, aby umyć larwy przed wylaniem wody z jaja. Powtórz trzy razy, a następnie ponownie zanurz larwy w wodzie z jaj. Aby uniknąć obrzęku serca i śmierci larw u larw leczonych Mtz, należy dodać niższe stężenie trikainy, o końcowym stężeniu 0,008%, w celu unieruchomienia larw.
- W celu analizy wątroby należy zbadać wielkość wątroby larw leczonych Mtz pod mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem CFP. Oceń poziom ablacji hepatocytów na podstawie względnej wielkości wątroby: duża (bez ablacji; 0-10% larw), średnia (częściowo poddana ablacji; 10-20%) i bardzo mała (całkowicie poddana ablacji; 80-90%).
