Krycie i ocena stopnia zaawansowania jaj: metoda generowania zarodków i sortowania ich według etapu rozwoju

Abstract

Źródło: Hostelley T.L., et al. Przygotowanie próbki i analiza danych o ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2017)

Artykuł opisuje protokół generowania zarodków danio pręgowanego poprzez naturalne kojarzenie i sortowanie ich etapów rozwoju. Protokół jest dalej wykorzystywany do analizy komórek β trzustki przy użyciu ryb transgenicznych.

Protocol

1. Tworzenie embrionów poprzez naturalne krycie

1. Hodowla zarodków do 3 miesiąca życia, dojrzałość reprodukcyjna.
2. Oddziel dorosłe samce i samice ryb od pożądanego szczepu do podzielonych zbiorników godowych wieczorem przed pobraniem zarodków i dodaj 2 samce i 3 samice do każdego zbiornika.
   UWAGA: Zastosowanie transgenicznego fluorescencyjnego szczepu reporterowego insuliny2a:mCherry pozwoliło na analizę komórek β trzustki.
3. Przenieś ryby do zbiornika godowego ze świeżą wodą systemową i wyjmij przegrodę natychmiast po zapaleniu się świateł następnego ranka.
4. Pozwól rybom łączyć się w pary w sposób naturalny, dopóki zarodki nie zostaną zaobserwowane w dolnym zbiorniku. Zbieraj zarodki w 30-minutowych odstępach, aż do pobrania żądanej ilości. Przechowywać każdy pobrany punkt czasowy na oddzielnych szalkach Petriego w pożywce dla zarodków w temperaturze 28,5 °C.
5. W razie potrzeby wykonać mikroiniekcję materiału genetycznego lub umieścić go w eksperymentalnych pożywkach hodowlanych i wyhodować zarodki w świeżej pożywce dla zarodków Hanka na 10-centymetrowych szalkach Petriego w temperaturze 28,5 °C.
   UWAGA: W przypadku analizy ekspresji genów u zwierząt z wstrzyknięciem morfolino (MO) lub zwierząt ze mutacją należy pamiętać, że każda manipulacja może mieć przypadkowy wpływ na ekspresję genów. Mutanty mogą wykazywać kompensację genetyczną na poziomie transkrypcji, który nie jest obserwowany przez celowanie genów oparte na MO.

2. Stadium zarodków

1. Hoduj zarodki w grupach po 50–75 zarodków na 10-centymetrową szalkę Petriego, aby zapewnić spójny czas rozwoju wszystkich zarodków.
2. Monitoruj morfologię rozwoju za pomocą mikroskopu preparacyjnego na etapie blastomeru, epibolii i somitu, aby zapewnić postęp rozwoju.
   UWAGA: Usuń wszelkie umierające lub zniekształcone zarodki, aby zapobiec opóźnieniu rozwoju w naczyniu.
3. Oddziel zarodki na podstawie wieku rozwojowego. Etap zarodków i larw na podstawie całkowitej długości ciała po 24 hpf.
   UWAGA: Somity to tkanka mezodermalna w kształcie szewronu obecna w grzbietowej części zarodka.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mWiśnia	ZIRC (Cyrk)	ZL1483
Zbiorniki łączące 1,0 l Zestaw zbiorników krzyżowych	Nurkowanie	ZHCT100
Mikroskop preparacyjny	Zeiss