Ekstrakcja DNA z klipsa ogonowego: metoda stosowana w genotypowaniu danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Xing L., et al. Szybkie i skuteczne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości. J. Vis. Exp. (2014).

Ten artykuł opisuje ekstrakcję DNA z klipsa do ogona danio pręgowanego. Protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę analizy genotypów danio pręgowanego.

Protokół

1. Przygotowanie DNA

1. Przygotuj bufor do lizy DNA: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Dodać świeżą proteinazę K do końcowego stężenia 1 mg/ml w dniu stosowania.
2. Pobieranie tkanek:
   1. Dla klipsa na płetwy dorosłej ryby:
      1. Znieczulenie ryby: Umieść rybę w 0,004% roztworze MS-222 (trikainy). Poczekaj, aż ruch skrzeli zwolni.
      2. Połóż rybę na stosie 5-10 chusteczek Kimwipes i odetnij mały kawałek płetwy ogonowej, około 2-3 mm, sterylną żyletką.
      3. Szybko umieść rybę w oznakowanym zbiorniku ze świeżą wodą w celu odzyskania zdrowia; ostrożnie oznacz zarówno zbiornik, jak i odpowiednią rurkę, która będzie zawierać klips płetwowy. Zmieniaj wodę i karm ryby co drugi dzień.
      4. Podnieś zacisk płetwy ze sterylną końcówką pipety i przenieś go do probówki wypełnionej 100 μl buforu do lizy DNA.
      5. Wyrzuć końcówkę pipety, a żyletkę wyrzuć do pojemnika na ostre przedmioty.
   2. W przypadku klipsa na ogon zarodka:
      1. Umieścić zarodki w 0,004% roztworze MS-222 (trikainy). Poczekaj 2 min.
      2. Wytnij kawałek ogona kleszczami pod mikroskopem preparacyjnym.
      3. Umieść ogon w oznakowanej probówce wypełnionej 30 μl buforem do lizy DNA.
      4. Szybko umieść zarodek w probówce zawierającej 100 μl 4% paraformaldehydu.
      5. Oznaczyć probówki z zarodkami i odpowiadającymi im rurkami ogonowymi.
      6. Probówki z zarodkami przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia.
      7. Oczyść kleszcze za pomocą wody Milli-Q i chusteczek Kimwipes między każdym zarodkiem, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
   3. Dla całych zarodków:
      1. Umieścić zarodki w 0,004% roztworze MS-222 (trikainy). Poczekaj 2 min.
      2. Umieść 1-5 zarodków w probówce wypełnionej 100 μl buforu do lizy DNA. Dechorionacja nie jest konieczna.
3. Trawienie DNA
   Inkubować probówki z tkankami (klipsami do płetw lub ogona lub zarodków) w temperaturze 55 °C przez 4 godziny, do nocy.
4. Dezaktywuj proteinazę K
   Podgrzewaj probówki do 95 °C przez 15 minut. DNA należy natychmiast użyć do PCR lub przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 Reaction LightScanner Master Mix	Ogień biologiczny	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Trikaina
Paraformaldehyd