Przygotowanie próbki do mikroskopii świetlnej: montaż żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania

Abstract

Źródło: Icha J., et al. Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego do zobrazowania rozwoju oka danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2016).

Ten artykuł opisuje przygotowanie próbki do mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkuszy świetlnych. Zademonstrowano również metodę montowania żywych zarodków danio pręgowanego w celu długoterminowego obrazowania, co pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Protocol

1. Przygotowanie próbki

1. Przygotowanie mieszanki agarozy
   1. 15 minut przed przygotowaniem mieszanki agarozy rozpuścić jedną 1 ml podwielokrotności 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (rozpuszczonej w pożywce E3) w bloku grzewczym ustawionym na temperaturę 70 °C. Gdy agaroza jest całkowicie stopiona, przenieś 600 μl do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml, dodaj 250 μl pożywki E3, 50 μl 0,4% MS-222 i 25 μl wirowego roztworu podstawowego z kulkami.
      nuta: Daje to 925 μl mieszanki, podczas gdy dodatkowe 75 μl oblicza się dla płynu dodawanego później razem z zarodkami.
   2. Przechowywać probówkę w drugim bloku grzewczym w temperaturze 38-40 °C lub upewnić się, że agaroza znajduje się bardzo blisko punktu żelowania przed włożeniem do niej próbek zarodków.
2. Montaż zarodków
   1. Weź pięć szklanych kapilar o objętości 20 μl (z czarnym znacznikiem, średnica wewnętrzna ~1 mm) i włóż do nich pasujące tłoki z końcówką teflonową. Przepchnąć tłok przez kapilarnę tak, aby końcówka teflonowa znalazła się na dnie kapilary.
   2. Przenieść pięć zarodków (liczbę, która może być zamontowana jednocześnie) za pomocą szklanej lub plastikowej pipety do probówki z wirowaną ciepłą mieszanką agarozy o temperaturze 37 °C.
      nuta: Staraj się przenosić minimalną objętość płynu razem z zarodkami.
   3. Włóż kapilarnę do mieszanki i zassaj jeden zarodek do środka, pociągając tłok do góry. Upewnij się, że głowa zarodka wchodzi do naczynia włosowatego przed ogonem. Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza między tłokiem a próbką. Nad zarodkiem powinno znajdować się ±2 cm agarozy, a pod nim ±1 cm. Powtórzyć te czynności dla pozostałych zarodków.
   4. Poczekaj, aż agaroza całkowicie się zestale, co nastąpi w ciągu kilku minut, a następnie przechowuj próbki w pożywce E3, przyklejając je do ścianki zlewki plasteliną lub taśmą. Dolny otwór kapilary powinien swobodnie zwisać w roztworze, umożliwiając wymianę gazową z próbką.
      UWAGA: Podobny protokół do sekcji 1.1 i 1.2 można również znaleźć na stronie wiki OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

2. Przykładowe pozycjonowanie

1. Zespół uchwytu próbki
   1. Włóż 2 plastikowe tuleje o odpowiednim rozmiarze (czarne) względem siebie do trzpienia uchwytu próbki. Ich rozcięte boki muszą być skierowane na zewnątrz. Przymocuj zaciskową luźno, obracając ją o 2-3 rundy. Przełóż kapilarnę przez clamp śruba i przepchnij ją przez uchwyt, aż pasek stanie się widoczny po drugiej stronie. Unikać dotykania tłoka.
   2. Dokręcić zaciskową. Wypchnij nadmiar 1 cm agarozy poniżej zarodka z naczynia włosowatego i odetnij go. Włóż trzpień do dysku uchwytu próbki.
   3. Potwierdź w oprogramowaniu, że stolik mikroskopu znajduje się w pozycji obciążenia. Użyj szyn prowadzących, aby wsunąć cały uchwyt z próbką pionowo w dół do mikroskopu. Obróć go tak, aby tarcza uchwytu magnetycznego zablokowała się na swoim miejscu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop Lightsheet Z.1	Mikroskopia Carla Zeissa
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Roth	Numer katalogowy 6351.1
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Sigma	A4018 lub A9414
Metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu (MESAB/ MS-222/Trikaina)	Sigma	E10521
20 μl (średnica wewnętrzna 1 mm, oznaczone na czarno) kapilki	marka	701904	Sprzedawane jako część zamienna do TransferPettor
Tłoki teflonowe do kapilar 20 μl	marka	701932	Sprzedawane jako część zamienna do TransferPettor