$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie zarodków
- Po kryciu zebrać zarodki w E3 na szalce Petriego i inkubować je w temperaturze 26,5 °C przez około 28 godzin przed zamontowaniem.
nuta: Spowalnia to rozwój zarodków, tak że zarodki są w wieku około 30 somitów na początku obrazowania.
- Znieczulać zarodki w 0,016-0,020% Trikainy w E3. Aby zahamować pigmentację, dodaj PTU do stężenia 200 μM.
- Odmówkować zarodki za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą dwóch kleszczy chwyć i delikatnie rozsuń kosmówkę, aby uwolnić zarodek.
2. Montaż w agarozie
UWAGA: Opracowana metoda montażu wymaga dwóch różnych stężeń niskotopliwej agarozy w E3 z 0,02% trikainy i PTU, w zależności od potrzeb. Pierwszy roztwór agarozy zawiera optymalne stężenie agarozy, przy którym zniekształcenia i ruchliwość są minimalne. Optymalizacja została opisana w kroku 5 poniżej.
- Podgrzać roztwory agarozy dla dwóch warstw (stężenie określone w kroku 5 poniżej i 1%) do temperatury 65 °C. Pozwól agarozie ostygnąć do około 30 °C tuż przed montażem, aby zarodek nie został uszkodzony przez ciepło. Do montażu należy używać naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i szklanym dnem nakrywkowym nr 0. Szkło nakrywkowe przymocowane do dna naczynia tworzy płytką (głębokość ok. 1,2 mm) studzienkę, w której ma zostać umieszczony zarodek.
nuta: W tym przypadku stężenie o najmniejszej ruchliwości i zniekształceniach mieściło się w przedziale od 0,025 do 0,040% agarozy.
- Delikatnie umieść zdekorionowany zarodek jedną z bocznych stron w kierunku dna naczynia za pomocą szklanej pipety lub mikropipety. W przypadku korzystania z mikropipety należy odciąć zewnętrzną część końcówki, aby zwiększyć rozmiar otworu w celu dopasowania do zarodka (ryc. 1A). Ostrożnie usuń pozostały E3 za pomocą mikropipety.
- Dodać pierwszy roztwór agarozy do małego dołka utworzonego przez szkło nakrywkowe przymocowane do dna naczynia, aby przykryć zarodek (warstwa 1) (ryc. 1B). Upewnij się, że agaroza zakrywa małą studzienkę, ale nie przeleje jej.
- Przykryj małą studzienkę szkłem nakrywkowym (22 mm x 22 mm) (ryc. 1C), aby utworzyć wąską przestrzeń wypełnioną agarozą z zarodkiem między dwoma szkłami nakrywkowymi.
- Umieść warstwę 1% roztworu agarozy na wierzchu szkła nakrywkowego na całym dnie naczynia (warstwa 2) (Rysunek 1D). Gdy ta warstwa krzepnie, utrzymuje szkło nakrywkowe na miejscu.
- Napełnij pozostałą część naczynia E3 zawierającym 0,02% trikainy, aby utrzymać nawodnienie systemu (warstwa 3) (rysunek 1E).
nuta: W tym zestawieniu szkło nakrywkowe i 1% agaroza chronią dolną warstwę przed rozcieńczeniem.
3. Optymalizacja roztworu agarozy dla warstwy 1
- Aby określić optymalne stężenie agarozy dla warstwy 1, należy zastosować wieloskalowe podejście do wyszukiwania w siatce. Umieszczaj zarodki w rosnących stężeniach agarozy w zakresie od 0,01% do 1%, a następnie wykonaj obrazowanie poklatkowe ograniczenia wzrostu i ruchliwości zarodka w polu widzenia. Zidentyfikuj stężenia, w których zarówno zniekształcenie, jak i ruchliwość są minimalne.
- Aby jeszcze bardziej zoptymalizować stężenie agarozy, należy dopasować zarodki przy użyciu drobniejszego zakresu stężeń agarozy (np. od 0,025 do 0,040% agarozy) w zależności od stężenia, które okazało się najlepsze w kroku 3.1 (np. 0,025%, 0,028%, 0,031% itd.).
nuta: W naszym laboratorium optymalne stężenie agarozy wynosiło około 0,03%.
