1. Konfiguracja mikroskopu, akwizycja, przetwarzanie i analiza obrazu
- Przygotuj 0,8% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP): Dodaj 0,8 g agarozy LMP do 100 ml E3 i podgrzewaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Na gorąco podamy 1 ml agarozy LMP do 1,5 ml probówek do mikrofuge w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C. Agaroza LMP pozostanie stopiona w temperaturze 37 °C. Dodać 40 μl 4 mg/ml (25x) pH 7,0 tricainy do każdej 1 ml podwielokrotności agarozy LMP w temperaturze 37 °C. UWAGA: W przypadku pracy ze szczepem pigmentowanym dodaj 20 μl 0,15% (50x) PTU do każdej podwielokrotności 1 ml.
- Pozostałą agarozę LMP przechowywać przez kilka miesięcy w szczelnie zamkniętych probówkach o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C.
- Znieczulenie zarodków parabiotycznych do obrazowania należy poprzez dodanie 1 ml trikainy o pH 4 mg/ml (25x) do 25 ml E3, w której zarodki już się znajdują
.
- Delikatnie zakręć naczyniem, aby zarodki zebrały się w środku. Następnie, za pomocą plastikowej pipety transferowej z szeroką końcówką, narysuj zarodki w jak najmniejszej ilości płynu. Obróć pipetę do góry pionowej i delikatnie odbij zarodki, aby osiadły na samym dnie pipety.
- Umieść zarodki na dnie pipety, przenieś je do 1 ml porcji agarozy LMP, lekko dotykając końcówką pipety powierzchni agarozy. Unikaj przenoszenia nadmiaru płynu, ponieważ spowoduje to rozcieńczenie agarozy.
- Po usunięciu nadmiaru płynu z pipety, za pomocą pipety delikatnie wymieszać zarodki w agarozie, a następnie za pomocą pipety przenieść całą agarozę i zarodki do dołka na szkiełku nakrywkowym (szkiełko nakrywkowe nr 1,5), płytce 6-dołkowej.
nuta: Należy pamiętać, aby wyrzucić pipetę po przeniesieniu zarodków na płytkę obrazową. Resztki agarozy osadzają się w pipecie, czyniąc ją nieskuteczną do dalszego użycia. Zamiast tego za każdym razem używaj nowej pipety.
- Pod stereoskopem użyj końcówki pipety z żelem zamocowanej na końcu igły do drażnienia z drewnianą rękojeścią, aby ustawić zarodki w dół w kierunku szkła nakrywkowego (aby upewnić się, że znajdują się w odległości roboczej obiektywu mikroskopu) i w pożądanej orientacji do obrazowania.
nuta: Zmieniaj pozycję w sposób ciągły, aż agaroza całkowicie się zetnie. Zwróć uwagę, aby zamontować zarodki parabiotyczne, zgodnie z którym zarodek pary ma być zobrazowany. Biorąc pod uwagę losową orientację zrośniętych zarodków, w przypadku niektórych par obrazowanie obu zarodków może być trudne. W tym scenariuszu należy odzyskać zarodki z agarozy za pomocą kleszczy i plastikowej pipety transferowej z szeroką końcówką, a następnie ponownie założyć w celu obrazowania z innej perspektywy.
- Gdy agaroza stężeje, zalej 2-3 ml E3 uzupełnionego trikainą (i PTU, jeśli to konieczne).
- Zobrazuj zarodki za pomocą odwróconej epi-fluorescencji szerokokątnej, skaningu laserowego konfokalnego lub mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. Wybierz obiektyw najbardziej odpowiedni dla żądanego obrazowania. Aby uzyskać pole widzenia całego zarodka, użyj obiektywu 4x. Wybierz większe powiększenie, takie jak obiektyw 20x, aby zobrazować określoną tkankę
nuta: Jeśli używasz mikroskopu pionowego, zamontuj agarozę LMP (podobną do powyższej) na szklanym szkiełku nakrywkowym. Odwróć szklane szkiełko nakrywkowe na szklane szkiełko mikroskopowe, które ma pierścień smaru próżniowego wypełnionego tym samym E3-trikainą-PTU.
- Przetwarzaj pozyskane obrazy za pomocą bezpłatnych pakietów oprogramowania do analizy obrazu, takich jak NIH Image J/FIJI.
nuta: Licz liczbę komórek i określaj ilościowo dynamikę, taką jak migracja i podział komórek, za pomocą algorytmów segmentacji i śledzenia.
