1: Aksotomia dwufotonowa przy użyciu specjalnie zbudowanego mikroskopu dwufotonowego z laserem Chameleon Ti-Sapphire
- Przygotuj się do obrazowania. Umieścić zamontowany zarodek (zarodki) na szkiełku podstawowym pod mikroskopem. Skoncentruj się na jednym zarodku za pomocą obiektywu wodnego 40X (0,8 NA). Włącz laser. Byliśmy w stanie w powtarzalny sposób wizualizować i uszkadzać neurony wyrażające GFP przy użyciu następujących parametrów. Aby uwidocznić aksony o mocy nieuszkadzającej, ustaw laser na długość fali 910 nanometrów (nm) i moc 30 miliwatów (mW podane są ilości energii w próbce). Otwórz oprogramowanie do obrazowania. Korzystamy z oprogramowania ScanImage opracowanego w laboratorium Karela Svobody.
- Naciśnij ostrość, aby zeskanować zarodek za pomocą lasera dwufotonowego, zlokalizuj akson, który chcesz aksotomizować, i uchwyć obraz tego aksonu. Zaznacz pierwszą i ostatnią pozycję Z, uzyskaj obraz i wykonaj maksymalną projekcję stosów Z.
- Powiększ 70-krotnie gałąź aksonu, którą chcesz aksotomizować i zatrzymaj skanowanie. Zwiększ mW na próbce do mocy niszczącej 180 mW i wykonaj pojedynczy skan za pomocą lasera. Robimy to, ustawiając liczbę plasterków Z na 1 i naciskając "Grab". To powinno wystarczyć do przecięcia aksonu. Zapoznaj się z dyskusją, aby zapoznać się z metodami optymalizacji tej procedury dla Twojego mikroskopu i celu eksperymentalnego.
- Pomniejsz, zmniejsz moc do 30 mW i zrób zdjęcie.
2: Aksotomia dwufotonowa w mikroskopie konfokalnym/dwufotonowym Zeiss 510
- Umieść zamontowany zarodek na stoliku i ustaw go w ostrości za pomocą soczewki wodnej 25X lub innego odpowiedniego obiektywu.
- Włącz lasery dwufotonowe (910 nm) i argonowe (488 nm) w trybie wielościeżkowym, aby możliwe było przełączanie z jednego na drugi. Chociaż oba lasery są używane do wykrywania GFP, emisja dwóch fotonów jest wizualizowana na czerwono, a emisja lasera argonowego na zielono, aby je rozróżnić.
- Użyj lasera argonowego, aby zidentyfikować akson, który ma zostać zraniony. W obszarze Ustawienia Z zaznacz pierwszą i ostatnią sekcję optyczną. Wykonaj obraz konfokalny i utwórz maksymalną projekcję stosu Z.
- Wybierz obszar aksonu, który ma zostać zraniony i ustaw ostrość na tym obszarze. Wyłącz laser argonowy i włącz laser dwufotonowy. Zeskanuj próbkę za pomocą dwufotonu przy intensywności lasera ~9% transmisji, aby upewnić się, że akson jest nadal ostry.
- Kliknij przycisk "zatrzymaj", aby narzędzie do przycinania było dostępne. Użyj kadrowania, aby powiększyć obszar zainteresowania. Zazwyczaj przybliżamy do ~70X (zoom można sprawdzić pod zakładką "tryb"). W zakładce "kanały" zmień intensywność transmisji dwufotonowej z ~9% na 15-20% transmisji.
- Aby odciąć akson, aktywuj przycisk "szybki XY" na około 1 sekundę, a następnie naciśnij przycisk stop, aby uniknąć nadmiernych uszkodzeń. Akson powinien być postrzegany jako rozrzucone szczątki, jeśli procedura zadziałała.
- Aby upewnić się, że akson został uszkodzony, przełącz się z powrotem na laser argonowy 488 nm, wykonaj kolejny obraz konfokalny i utwórz maksymalną projekcję.