Optogenetyka danio pręgowanego: aktywacja genetycznie zmodyfikowanego neuronu somatosensorycznego w celu zbadania reakcji behawioralnych larw

Streszczenie

Źródło: Palanca A. M. S., et al. Optogenetyczna aktywacja neuronów somatosensorycznych danio pręgowanego za pomocą ChEF-tdTomato. J. Vis. Exp. (2013).

Ten film opisuje techniki optogenetyczne poprzez aktywację genetycznie zmodyfikowanych neuronów somatosensorycznych i rejestrowanie wywołanych reakcji behawioralnych za pomocą szybkiej kamery wideo.

Protokół

1. Larwy wierzchowca do eksperymentów behawioralnych

1. Przygotuj 1,5% niskotopliwej agarozy w ddH2O i przechowuj w bloku grzewczym o temperaturze 42 °C, aby zapobiec jej zestaleniu.
2. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś jedną z wstępnie przesianych larw do probówki z 1,5% agarozą o niskiej temperaturze topnienia z jak najmniejszą ilością wody niebieskiej/zarodkowej.
3. Przenieś larwy w kropli agarozy na małą szalkę Petriego.
4. Pod mikroskopem preparacyjnym ustaw larwę grzbietowo do góry.
5. Gdy agaroza zastygnie, odetnij agarozę cienką żyletką (skalpel #11), pozostawiając klin agaru wokół całej larwy.
6. Wykonaj dwa ukośne nacięcia po obu stronach żółtka; uważając, aby nie naciąć larwy.
7. Wypełnij obszar otaczający agarozę zarodkiem/niebieską wodą.
8. Odciągnij agarozę od tułowia i ogona larwy (ryc. 1).

2 . Przygotowanie oprogramowania do szybkiej kamery i obrazowania

1. Zamontuj szybką kamerę na lunecie sekcyjnej.
2. Podłącz aparat do komputera.
3. Włącz komputer.
4. Włącz szybką kamerę.
5. Otwórz oprogramowanie do obrazowania (używamy oprogramowania do obrazowania AOS i opiszemy procedury korzystania z niego tutaj, ale inne oprogramowanie do obrazowania jest równie dopuszczalne).
6. Dostosuj odpowiednio ustawienia aparatu (np. 1,000 klatek na sekundę (kl./s), 50% bufora spustu lub inne preferowane ustawienia).
7. Rozpocznij nagrywanie.

3. Aktywuj pojedyncze neurony za pomocą lasera o długości fali 473 nm

1. Podłącz stymulator, laser i optyczny.
2. Włącz stymulator.
3. Ustaw stymulator na maksymalnie 5 woltów i czas trwania impulsu 5 ms.
4. Włącz laser zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby umieścić końcówkę optycznego w pobliżu ciała komórki neuronu z ekspresją ChEF-tdTomato (ryc. 1).
6. Dostarcz impuls niebieskiego światła, aby aktywować neuron czuciowy.
7. Nagrywaj zachowanie za pomocą szybkiej kamery ustawionej na 500 lub 1,000 klatek na sekundę.
8. Powtórz eksperyment zgodnie z potrzebami, odczekując 1 minutę między każdą aktywacją, aby uniknąć przyzwyczajenia. (Rejestrujemy co najmniej trzy odpowiedzi dla każdego neuronu).
9. Aby uwolnić larwy, podważ agarozę kleszczami, uważając, aby nie zranić zwierzęcia. Zwierzęciu temu można pozwolić na dalszy rozwój, a procedurę można powtórzyć na starszym etapie, aby scharakteryzować rozwój zachowania. Zarodek można również ponownie zamontować w celu obrazowania konfokalnego aktywowanej komórki w wysokiej rozdzielczości w celu skorelowania zachowania ze strukturą komórkową, jak opisano poniżej.
10. Przenieść larwę na płytkę hodowlaną ze świeżą wodą niebieską/zarodkową. Używamy 24-dołkowej płytki do śledzenia poszczególnych larw.

Wyniki

Rysunek 1. Schemat zamontowanej larwy danio pręgowanego i reprezentatywnych neuronów zaangażowanych w reakcję larw na dotyk. Larwy danio pręgowanego były częściowo osadzone w 1,5% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (reprezentowanej przez przerywane linie otaczające rostralną część larwy). Neuron trójdzielny (w głowie) i neuron Rohon-Beard (w tułowiu) są pokazane na czerwono. Komórki Mauthnera są obrysowane przery...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Sigma	A9045	lub równoważne
szalka Petriego (100x15 mm)	jakikolwiek	jakikolwiek
Niesterylne ostrza skalpela	Doskonałe narzędzia naukowe, Inc.	Numer katalogowy 10011-00	lub równoważne
Woda niebieska/zarodkowa			10 L ddH2O 0,6 g Instant Ocean 6 kropli błękitu metylenowego
Kamera o dużej szybkości	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	lub równoważne
Szklana pipeta Pasteura	rybak	1367820B	lub równoważny (średnica 10-15 mm)
Przenośny laser 473 nm	Lasery kryształkowe	CL-473-050	lub większa moc, z opcją TTL
Stymulator S48	Astro-Med, Inc. Oddział Grass Instrument	Zobacz materiał S48K	lub równoważne
Trikaina	Sigma	Ciągnik hamulcowy A5040
Światłowód 200 μm	ThorLabs powiedział:	AFS200/220Y-NIESTANDARDOWY	Patchcord, Długość: 3 m, Koniec A: FC/PC, Koniec B: FC/PC, Kurtka: FT030
Światłowód 50 μm	ThorLabs powiedział:	AFS50/125Y-NIESTANDARDOWY	Patchcord, Długość: 3 m, Koniec A: FC/PC, Koniec B: FC/PC, Kurtka: FT030
24 płytki hodowlane	Genesee	25-102	lub równoważne