Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Streszczenie

Źródło: Roy, B., et al. Nagrania z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2013).

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Protokół

1. Nagrywanie z użyciem zacisku krosowego (tryb całej komórki)

1. Wszystkie nagrania wykonywane są w trybie patch clamp całego ogniwa. Komory rejestracyjne umieszcza się na stoliku mikroskopowym w układzie elektrofizjologicznym. Nasze stoliki są zamocowane, a pionowy mikroskop z zaciskiem krosowym jest przykręcony do ruchomej platformy mikroskopu lub translatora mikroskopowego.
2. Pipety z zaciskiem krosowym są naciągane na poziomy ściągacz (P-97; Sutter Instruments Co.) z cienkościennego, borokrzemianowego szkła otrzymywanego z WPI. Średnice końcówek pipet są rzędu 0,2-0,4 μm po wypolerowaniu ogniowym do gładkiej krawędzi, a stożek trzpienia ma długość ~4 mm.
3. Podłącz pipetę do amplifier head-stage w konfiguracji elektrofizjologii. Ważne jest, aby stopień głowicy był ustawiony pod kątem około 45° do osi poziomej, ponieważ zapewnia to kąt wejścia pipety, który jest odpowiedni do tworzenia uszczelek o wysokiej rezystancji na kuwecie Mauthnera.
4. Tuż przed wejściem do roztworu do kąpieli należy przyłożyć niewielką ilość nadciśnienia do pipety, aby zmniejszyć ryzyko zabrudzenia końcówki. Podczas rejestrowania mEPSC, roztwory do kąpieli zawierają 1 μM TTX do blokowania potencjałów czynnościowych, 5 μM strychniny do blokowania receptorów glicyny i 10 μM bicukuliny lub 100 μM pikrotoksyny do blokowania receptorów GABAA. Podczas rejestrowania mIPSC, roztwory do kąpieli zawierają 1 μM TTX, kwas kynureninowy i bikukulinę lub strychninę, w zależności od aktywności receptora będącego przedmiotem zainteresowania.
5. Zbliżyć się do M-cell z niewielką ilością dodatniego ciśnienia w pipecie. Nadciśnienie delikatnie popycha komórkę z boku na bok, a po umieszczeniu bezpośrednio nad komórką tworzy mały wgłębienie na błonie komórkowej. Pozostaw pipetę na miejscu na kilka sekund, aby delikatnie oczyścić powierzchnię komórki, aby można było utworzyć mocne uszczelnienie między pipetą a membraną. Uwolnienie nadciśnienia w pipecie pozwala na zainicjowanie zgrzewu, a niewielka ilość podciśnienia w połączeniu z ujemnym potencjałem pipety powoduje powstanie zgrzewów GigaΩ w ciągu kilku sekund.
6. Zmień potencjał podtrzymania na wzmacniaczu na -60 mV. Rozerwij błonę komórkową serią krótkich impulsów ssania. Natychmiast rejestruj potencjały membranowe i minimalizuj artefakty pojemności. Kompensacja pojemności ogniwa (Cm) i rezystancji dostępu (szeregowego) (Ra) o 70-85%. Ra powinno być rutynowo monitorowane, co 30 sekund do minuty, a jeśli nastąpi zmiana o 20% lub więcej, przerwać eksperyment.
7. Po zakończeniu eksperymentu i zebraniu wystarczającej ilości danych, preparat poświęca się poprzez usunięcie tyłomózgowia za pomocą kleszczy. W tym momencie można rozpocząć analizę danych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ściągacz do pipet	Sutter Instruments Co	Zobacz materiał P-97
Pionowy mikroskop z zaciskiem krosowym	Mikrosystemy Leica	DMLFSA (Biblioteka DMLFSA)
wzmacniacz	Urządzenia molekularne	200 mld
Mikromanipulator	Siskiyou Inc.	MX7500