Wstrzyknięcie domięśniowe (IM): Podanie związku do mięśnia grzbietowego dorosłego danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Myllymäki, H., et al. Immunizacja dorosłych ryb danio pręgowanego do przedklinicznych badań przesiewowych szczepionek opartych na DNA. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje technikę wstrzykiwania domięśniowego w celu dostarczania związków do mięśni grzbietowych dorosłego danio pręgowanego.

Protokół

1. Wstrzyknięcie szczepionki DNA i elektroporacja

1. Do szczepień zgodnie z tym protokołem należy używać zdrowych, 6 do 12 miesięcznych dorosłych danio pręgowanego. Rybę należy przechowywać w systemie przepływowym z cyklem 14/10 godzin światła/ciemności, przy czym na 1 l wody przypada maksymalnie siedem ryb.
2. Przygotować 0,02% roztwór estru etylowego (trikainy) kwasu 3-aminobenzoesowego (pH 7) w wodzie w zbiorniku w celu znieczulenia ryb. Użyj 10-centymetrowej szalki Petriego lub czegoś podobnego.
3. Przygotować zbiornik odzysku, napełniając zlewkę o pojemności 5 l 3 litrami czystej wody z systemu.
4. Przygotuj wyściółkę do szczepienia, aby utrzymać rybę w ustalonej pozycji podczas szczepienia. Weź 5 x 7 cm² kawałki gąbki o grubości od 2 do 3 cm. Wytnij rowek w gąbce ostrzem skalpela lub ostrymi nożyczkami.
   nuta: Ta sama wyściółka do szczepień może być używana w wielu eksperymentach. Zdezynfekuj gąbkę między eksperymentami, mocząc ją w 70% alkoholu etylowym i pozostaw do wyschnięcia.
5. Dokładnie namocz gąbkę w wodzie systemowej i umieść gąbkę na szalce Petriego.
6. Pościć rybę 24 godziny przed szczepieniami.
7. Znieczul jednego danio pręgowanego, umieszczając go na szalce Petriego zawierającej 0,02% trikainy. Poczekaj, aż ryba nie zareaguje na stymulację dotykową i nie będzie ruchu skrzeli. Znieczulaj pojedynczą rybę na raz.
8. Za pomocą plastikowej łyżki przenieś znieczulonego danio pręgowanego na mokrą gąbkę i umieść brzuszną stronę ryby w dół w rowku. W prawidłowej pozycji upewnij się, że głowa i większość ciała ryby znajdują się wewnątrz rowka, a płetwa grzbietowa i ogon wystają z rowka.
9. Pod mikroskopem ostrożnie umieść igłę pod kątem około 45° w pobliżu mięśnia grzbietowego danio pręgowanego, używając pokręteł dostrajających osi x i y na mikromanipulatorze.
10. Znajdź małe miejsce bez łusek przed płetwą grzbietową, w którym popychanie igły nie wymaga siły. Jeśli wyczuwalny jest opór, wypróbuj sąsiednie miejsce. Unikaj zranienia kręgosłupa, płetwy grzbietowej lub łusek.
    nuta: Jeśli igła wygina się podczas pchania, należy ją lekko skrócić, przecinając ją.
11. Za pomocą przełącznika nożnego należy stopniowo wstrzykiwać roztwór szczepionki do mięśnia. Obserwuj wstrzyknięcie przez mikroskop: czerwień fenolowa jest widoczna, gdy dostaje się do tkanki mięśniowej. W razie potrzeby dostosuj czas trwania impulsu.
    nuta: Alternatywnie do wtrysku należy użyć przycisku inicjatora impulsów na przednim panelu pompy pneumatycznej. Jednak zastosowanie zdalnego przełącznika nożnego pozwala na użycie drugiej ręki do regulacji długości impulsu za pomocą 10-obrotowego pokrętła. Należy unikać zbyt szybkiego wstrzykiwania roztworu, ponieważ może to spowodować nadmierne uszkodzenie tkanek. Należy pamiętać, aby nie wstrzykiwać powietrza.
12. Rybę należy naelektryzować elektrycznie, natychmiast po wstrzyknięciu. Upewnij się, że ryba jest nadal pod narkozą. Trzymaj rybę na gąbce i umieść rybę między elektrodami typu pęseta, tak aby elektrody znajdowały się po obu stronach miejsca wstrzyknięcia. Nie dociskaj pęsety elektrod zbyt mocno, ale utrzymuj obie elektrody w kontakcie z rybą.
    1. Naciśnij przycisk start na elektroporatorze, aby wysłać sześć impulsów 40 V, 50 ms.
    2. Delikatnie przenieś rybę do zbiornika rekonwalescencyjnego.
    3. Wyczyść elektrody po każdej elektroporacji, przecierając je 70% etanolem.
       nuta: Uważnie monitoruj samopoczucie ryb po szczepieniu. Poddaj eutanazji każdą rybę wykazującą oznaki dyskomfortu (powolny powrót do zdrowia po znieczuleniu, nieprawidłowe pływanie, sapanie) w 0,04% tricaine. Po wyzdrowieniu przenieś rybę do jednostki przepływowej i nakarm ją normalnie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól sodowa czerwieni fenolowej	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy 114537-5G
Trikaina (sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu)	Sigma	A5040-100g	Rozwiązanie w zakresie anestezji i eutanazji
Zestawy elektrod pęsetowych (7 mm)	Aparatura BTX Harvard	BTX 450165	Elektrody typu pęseta
Kapilary glinokrzemianowe	Aparatura harwardzka	30-0108
Mikromanipulator	Narishige powiedział:	MA-153 (wersja angielska)
mikroskop	Olympus	Zobacz materiał ZS61
ECM Electro Square Porator	Aparatura BTX Harvard	Moduł BTX ECM 830
Plastikowa łyżka
gąbka
Stół warsztatowy ze styropianu