Wstrzyknięcie dootrzewnowe: metoda dostarczania roztworu do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Luukinen, H., et al. Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje technikę iniekcji dootrzewnowej, metodę dostarczania roztworów do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego.

Protokół

1. Eksperymentalne zakażenie M. marinum za pomocą iniekcji dootrzewnowej

1. Odpipetować kroplę 5 μl rozcieńczonego roztworu bakteryjnego na kawałek folii parafilmowej i wciągnąć kroplę do igły insuliny o stężeniu 30 g.
2. Do eksperymentu użyj 5–8 miesięcznych ryb typu dzikiego i zmutowanych ryb rag1−/−hu1999. Znieczulenie dorosłej danio pręgowanej w wodzie w zbiorniku 0,02% estru etylowego kwasu 3-aminobenzoesowego (pH 7,0). Umieść rybę brzuszną stroną do góry w szczelinie na wilgotnym spienionym plastiku.
   UWAGA: Zmutowane ryby Rag-/- nie są w stanie przejść rekombinacji somatycznej i wytworzyć funkcjonalnych limfocytów T i B.
3. Wstrzyknąć igłę między płetwy brzuszne pod kątem około 45°. Trzymaj igłę otworem do góry, aby zauważyć, że cały otwór znajduje się wewnątrz jamy brzusznej. Powoli wstrzyknąć zawiesinę bakteryjną i ostrożnie wyjąć igłę.
   nuta: W przypadku gdy czerwony znacznik wycieka z ryby po wstrzyknięciu, należy wykluczyć rybę z doświadczenia.
4. Natychmiast po wstrzyknięciu należy przenieść rybę do zbiornika regeneracyjnego ze świeżą wodą w zbiorniku.
5. Pobierać próbki zawiesiny bakteryjnej na płytkach 7H10 co 15 minut z używanej podwielokrotności bakteryjnej i inkubować bakterie w temperaturze 29 °C przez 5 dni i weryfikować dawkę infekcyjną, licząc kolonie na płytkach.
6. Regularnie sprawdzaj dobrostan ryb i poddaj eutanazji każdą rybę z objawami infekcji za pomocą estru etylowego kwasu 3-aminobenzoesowego o stężeniu powyżej 0,02% (pH 7,0).
   nuta: Około 7% dorosłych danio pręgowanego zakażonych 34 ± 15 CFU i 30% danio pręgowanego zakażonych 2029 ± 709 CFU będzie miało objawy do 8 tygodni. Objawy mogą obejmować nieprawidłowe pływanie, brak reakcji na dotyk, sapanie, obrzęk lub obserwowane wyniszczenie.
7. Utrzymuj danio pręgowanego zgodnie ze wspólnymi standardami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mycobacterium marinum (Mycobacterium marinum)	Kolekcja kultur typu amerykańskiego	Zobacz materiał ATCC 927
Czerwień fenolowa	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3532
Tabletki z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Middlebrock 7H10 agar	BD, Thermo Fisher Naukowy	11799042
Ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego (pH 7,0)	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5040
Igła do insuliny Omnican 100 30 G	Braun	9151133
Strzykawka 1 ml	Henke Sass Wilk	4010.200V0