1. Eksperymentalne zakażenie M. marinum za pomocą iniekcji dootrzewnowej
<ol>
	<li>Odpipetować kroplę 5 μl rozcieńczonego roztworu bakteryjnego na kawałek folii parafilmowej i wciągnąć kroplę do igły insuliny o stężeniu 30 g.</li>
	<li>Do eksperymentu użyj 5–8 miesięcznych ryb typu dzikiego i zmutowanych ryb rag1−/−hu1999. Znieczulenie dorosłej danio pręgowanej w wodzie w zbiorniku 0,02% estru etylowego kwasu 3-aminobenzoesowego (pH 7,0). Umieść rybę brzuszną stroną do góry w szczelinie na wilgotnym spienionym plastiku. 
	UWAGA: Zmutowane ryby Rag-/- nie są w stanie przejść rekombinacji somatycznej i wytworzyć funkcjonalnych limfocytów T i B.</li>
	<li>Wstrzyknąć igłę między płetwy brzuszne pod kątem około 45°. Trzymaj igłę otworem do góry, aby zauważyć, że cały otwór znajduje się wewnątrz jamy brzusznej. Powoli wstrzyknąć zawiesinę bakteryjną i ostrożnie wyjąć igłę. 
	nuta: W przypadku gdy czerwony znacznik wycieka z ryby po wstrzyknięciu, należy wykluczyć rybę z doświadczenia.</li>
	<li>Natychmiast po wstrzyknięciu należy przenieść rybę do zbiornika regeneracyjnego ze świeżą wodą w zbiorniku.</li>
	<li>Pobierać próbki zawiesiny bakteryjnej na płytkach 7H10 co 15 minut z używanej podwielokrotności bakteryjnej i inkubować bakterie w temperaturze 29 °C przez 5 dni i weryfikować dawkę infekcyjną, licząc kolonie na płytkach.</li>
	<li>Regularnie sprawdzaj dobrostan ryb i poddaj eutanazji każdą rybę z objawami infekcji za pomocą estru etylowego kwasu 3-aminobenzoesowego o stężeniu powyżej 0,02% (pH 7,0). 
	nuta: Około 7% dorosłych danio pręgowanego zakażonych 34 ± 15 CFU i 30% danio pręgowanego zakażonych 2029 ± 709 CFU będzie miało objawy do 8 tygodni. Objawy mogą obejmować nieprawidłowe pływanie, brak reakcji na dotyk, sapanie, obrzęk lub obserwowane wyniszczenie.</li>
	<li>Utrzymuj danio pręgowanego zgodnie ze wspólnymi standardami.</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mycobacterium marinum (Mycobacterium marinum) </td>
			<td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego </td>
			<td>Zobacz materiał ATCC 927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czerwień fenolowa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Zobacz materiał P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletki z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H10 agar</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Naukowy</td>
			<td>11799042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego (pH 7,0)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Ciągnik hamulcowy A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igła do insuliny Omnican 100 30 G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9151133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strzykawka 1 ml</td>
			<td>Henke Sass Wilk</td>
			<td>4010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wstrzyknięcie dootrzewnowe: metoda dostarczania roztworu do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego

Źródło: Luukinen, H., et al. <a href="https://www.jove.com/v/58299/" target="_blank">Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum</a>. J. Vis. Exp. (2018).
Ten film opisuje technikę iniekcji dootrzewnowej, metodę dostarczania roztworów do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego.

Wstrzyknięcie dootrzewnowe: metoda dostarczania roztworu do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego

Źródło: Luukinen, H., et al. Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum.  J. Vis. Exp. (2018).
Ten film opisuje ...

- Pościć dorosłą rybę przez 24 godziny przed wstrzyknięciem, aby opróżnić przewód pokarmowy i stworzyć dodatkową przestrzeń w jamie brzusznej. W dniu zabiegu znieczulij rybę tricainą i umieść ją w szczelinie w mokrej gąbce stroną brzuszną skierowaną do góry.
Następnie należy odpipetować żądaną ilość roztworu do wstrzykiwań na kawałek folii laboratoryjnej i wciągnąć ją do igły insulinowej. Umieść igłę między płetwami brzusznymi pod kątem 45 stopni od przedniej i tylnej osi ciała i delikatnie wepchnij ją w linii środkowej. Wsuń igłę o około 1 do 2 milimetrów do jamy brzusznej, przestrzeni między ścianą brzucha a narządami wewnętrznymi i powoli wstrzyknij interesujący Cię roztwór. Odczekaj pięć sekund przed wyciągnięciem igły, aby uniknąć rozlania. Teraz ostrożnie wyjmij igłę.
Po wstrzyknięciu należy szybko przenieść rybę do zbiornika regeneracyjnego zawierającego świeżą wodę w zbiorniku. Jeśli ryba nie zacznie od razu pływać, zakręć wodą w pobliżu skrzeli, aby pomóc jej dojść do siebie po znieczuleniu. W przykładowym protokole wstrzykniemy roztwór Mycobacterium marinum do zmutowanej ryby RAG1 w celu zbadania infekcji.
- Najpierw wyciśnij 5 mikrolitrów kropli rozcieńczonego roztworu bakteryjnego na kawałek folii parafinowej. Następnie wciągnąć kropelkę do igły insuliny o rozmiarze 30 G. Do tego eksperymentu użyj ryb w wieku od pięciu do ośmiu miesięcy, z których jedna jest rybą typu dzikiego, a druga zmutowaną rybą RAG.
Umieść te ryby brzuszną stroną do góry w szczelinach kawałka wilgotnego spienionego plastiku. Wstrzyknąć igłę insuliny między płetwy brzuszne pod kątem 45 stopni. Trzymaj igłę otworem do góry, aby upewnić się, że cały otwór znajduje się wewnątrz jamy brzusznej. Następnie powoli wstrzyknij roztwór bakteryjny. Następnie ostrożnie wyjmij igłę i natychmiast przenieś rybę do zbiornika regeneracyjnego wypełnionego świeżą wodą ze zbiornika.
Próbki z używanej podwielokrotności bakteryjnej pobierać co 15 minut na płytkach 7H10. Inkubuj te próbki w temperaturze 29 stopni Celsjusza przez pięć dni, aby zweryfikować dawkę infekcji. Regularnie sprawdzaj samopoczucie ryb, upewniając się, że wszystkie ryby z objawami infekcji zostały poddane eutanazji poprzez inkubację w wodzie z więcej niż 0,02% estru etylowego kwasu 3-aminobenzoesowego.

intraperitoneal-injection-method-solution-delivery-into-abdominal

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biology

Danio rerio (zebrafish)

Adult

Intraperitoneal Injection: A Method of Solution Delivery into the Abdominal Cavity of an Adult Zebrafish

8.3K Views. - Pościć dorosłą rybę przez 24 godziny przed wstrzyknięciem, aby opróżnić przewód pokarmowy i stworzyć dodatkową przestrzeń w jamie brzusznej. W dniu zabiegu znieczulij rybę tricainą i umieść ją w szczelinie w mokrej gąbce stroną brzuszną skierowaną do góry. Następnie należy odpipetować żądaną ilość roztworu do wstrzykiwań na kawałek folii laboratoryjnej i wciągnąć ją do igły insulinowej. Umieść igłę między płetwami brzusznymi pod kątem 45 s...

Wstrzyknięcie dootrzewnowe: metoda dostarczania roztworu do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego

In This Article

Abstract

Protocol

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles

Name	Company	Catalog Number
Mycobacterium marinum (Mycobacterium marinum)	Kolekcja kultur typu amerykańskiego	Zobacz materiał ATCC 927
Czerwień fenolowa	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3532
Tabletki z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Middlebrock 7H10 agar	BD, Thermo Fisher Naukowy	11799042
Ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego (pH 7,0)	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5040
Igła do insuliny Omnican 100 30 G	Braun	9151133
Strzykawka 1 ml	Henke Sass Wilk	4010.200V0