Aby wyświetlić tę treść, wymagana jest subskrypcja JoVE. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Abstract

Źródło: Luukinen, H., et al. Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje technikę iniekcji dootrzewnowej, metodę dostarczania roztworów do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego.

Protocol

1. Eksperymentalne zakażenie M. marinum za pomocą iniekcji dootrzewnowej

1. Odpipetować kroplę 5 μl rozcieńczonego roztworu bakteryjnego na kawałek folii parafilmowej i wciągnąć kroplę do igły insuliny o stężeniu 30 g.
2. Do eksperymentu użyj 5–8 miesięcznych ryb typu dzikiego i zmutowanych ryb rag1−/−hu1999. Znieczulenie dorosłej danio pręgowanej w wodzie w zbiorniku 0,02% estru etylowego kwasu 3-aminobenzoesowego (pH 7,0). Umieść rybę brzuszną stroną do góry w szczelinie na wilgotnym spienionym plastiku.
   UWAGA: Zmutowane ryby Rag-/- nie są w stanie przejść rekombinacji somatycznej i wytworzyć funkcjonalnych limfocytów T i B.
3. Wstrzyknąć igłę między płetwy brzuszne pod kątem około 45°. Trzymaj igłę otworem do góry, aby zauważyć, że cały otwór znajduje się wewnątrz jamy brzusznej. Powoli wstrzyknąć zawiesinę bakteryjną i ostrożnie wyjąć igłę.
   nuta: W przypadku gdy czerwony znacznik wycieka z ryby po wstrzyknięciu, należy wykluczyć rybę z doświadczenia.
4. Natychmiast po wstrzyknięciu należy przenieść rybę do zbiornika regeneracyjnego ze świeżą wodą w zbiorniku.
5. Pobierać próbki zawiesiny bakteryjnej na płytkach 7H10 co 15 minut z używanej podwielokrotności bakteryjnej i inkubować bakterie w temperaturze 29 °C przez 5 dni i weryfikować dawkę infekcyjną, licząc kolonie na płytkach.
6. Regularnie sprawdzaj dobrostan ryb i poddaj eutanazji każdą rybę z objawami infekcji za pomocą estru etylowego kwasu 3-aminobenzoesowego o stężeniu powyżej 0,02% (pH 7,0).
   nuta: Około 7% dorosłych danio pręgowanego zakażonych 34 ± 15 CFU i 30% danio pręgowanego zakażonych 2029 ± 709 CFU będzie miało objawy do 8 tygodni. Objawy mogą obejmować nieprawidłowe pływanie, brak reakcji na dotyk, sapanie, obrzęk lub obserwowane wyniszczenie.
7. Utrzymuj danio pręgowanego zgodnie ze wspólnymi standardami.

Materials

Mycobacterium marinum 	American Type Culture Collection 	ATCC 927
Phenol red	Sigma-Aldrich	P3532
Phosphate buffered saline tablets (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Middlebrock 7H10 agar	BD, Thermo Fisher Scientific	11799042
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	A5040
Omnican 100 30 G insulin needle	Braun	9151133
1 mL syringe	Henke Sass Wolf	4010.200V0