Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Sorlien, E. L., et al. Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Protokół

1. Mikroiniekcja składników CRISPR do zarodków danio pręgowanego

1. Ustaw zbiorniki hodowlane na noc przed wstrzyknięciem, umieszczając liczbę pożądanych samców i samic (zwykle 2 samice i 1 lub 2 samce) w zbiorniku hodowlanym z umieszczoną przegrodą.
2. Przygotować płytkę do mikroiniekcji z 1,5% agarozą w 1x pożywce E3 (patrz tabela materiałów) z 0,01% błękitem metylenowym (fungicydem), wlewając 35 ml stopionej agarozy na 10-centymetrową szalkę Petriego i delikatnie połóż plastikową formę, aby utworzyć w roztworze koryta w kształcie klina, stukając w formę w celu wyeliminowania pęcherzyków powietrza.
3. Pozostawić agarozę do zastygnięcia i przechowywać naczynie z niewielką ilością podłoża i zawinąć w folię parafinową, aby zapobiec wysychaniu talerza w temperaturze 4 °C.
   nuta: Płytki iniekcyjne są wielokrotnego użytku przez kilka tygodni, aż studzienki ulegną deformacji lub wyschną lub płyta zacznie pleśnieć.
4. Rano w dniu wstrzyknięcia rozmrozić oczyszczone białko sgRNA i Cas9 na lodzie. Pamiętaj, aby obchodzić się ze wszystkimi materiałami w rękawicach, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą i używać końcówek i probówek wolnych od RNaz.
5. Wygeneruj 5 μl roztworu do wstrzykiwań, łącząc białko Cas9 i sgRNA w stosunku 2:1 Cas9:sgRNA, aby uzyskać końcowe stężenia 400 pg/nL białka Cas9 i 200 pg/nL sgRNA. Inkubować roztwór Cas9/sgRNA w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić Cas9 i sgRNA utworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego. Dodać 0,5 μl 2,5% wag./obj. roztworu czerwieni fenolowej (patrz tabela materiałów) i wodę wolną od RNaz do końcowej objętości 5 μl.
   nuta: Wykazano, że siła jonowa roztworu wpływa na rozpuszczalność kompleksu Cas9/sgRNA, dlatego dodanie KCl może zwiększyć wydajność cięcia sgRNA, które wykazują niskie tworzenie indelu.
6. Wykonać igłę do wstrzykiwań, pociągając szklaną kapilarnę o średnicy 1,0 mm za pomocą ściągacza do mikropipet. Odetnij końcówkę świeżo przygotowanej igły za pomocą nowej żyletki lub kleszczy, aby uzyskać kątowy otwór, który z łatwością przebije kosmówkę i woreczek żółtkowy.
7. Umieścić igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikrowtryskiwacza przy włączonym źródle powietrza. Pod mikroskopem świetlnym przy użyciu powiększenia odpowiedniego do kalibracji określonej dla danego aparatu, wyreguluj ciśnienie wstrzykiwania, aż igła konsekwentnie wyrzuci roztwór o stężeniu 1 nL na szalkę Petriego wypełnioną olejem mineralnym.
   nuta: Jakość igły ma kluczowe znaczenie. Ćwicz wytwarzanie igły i wstrzykiwanie do woreczka żółtkowego zarodków, aż do opanowania tej umiejętności przed przystąpieniem do dalszych eksperymentów.
8. Zdejmij przegrodę i pozwól rybom rozmnażać się przez około 15 minut.
   nuta: Dłuższy czas rozmnażania pozwoli na uzyskanie większej liczby zarodków, jednak wstrzyknięcie powinno zostać zakończone, gdy zarodki są na etapie 1 komórki, aby zmaksymalizować szansę na wczesne cięcie Cas9, a tym samym zmniejszyć mozaikowość genetyczną. Zarodki mogą być wstrzykiwane w późniejszych stadiach (2-4 stadia komórkowe), ale może to zmniejszyć szybkość transmisji w linii zarodkowej zmodyfikowanego allelu.
9. Zbierz jajka za pomocą sitka i opłucz je na 10 cm szalce Petriego za pomocą 1x pożywki E3 z 0,0001% błękitu metylenowego. Zbadaj stan zdrowia jaj pod mikroskopem świetlnym, usuwając wszelkie niezapłodnione jaja i zanieczyszczenia.
10. Odłóż 10-15 zarodków jako niewstrzykniętą kontrolę na oddzielnej, oznakowanej szalce Petriego.
11. Za pomocą pipety transferowej delikatnie ułożyć jaja na płytce iniekcyjnej podgrzanej do temperatury pokojowej.
12. Pod mikroskopem preparacyjnym przy 2,5-krotnym powiększeniu wstrzyknąć 1 nl roztworu do woreczka żółtkowego każdego zarodka, aby wstrzyknąć łącznie 400 pg białka Cas9 i 200 pg sgRNA.
    nuta: Aby zwiększyć cięcie, jeśli jest to pożądane lub konieczne, zwiększyć końcowe stężenie białka Cas9 do 800 pg/nL i sgRNA do 400 pg/nL w roztworze do wstrzykiwań; Może to jednak również zwiększyć cięcie poza celem i/lub pogorszyć zdrowie zarodków. Wydajność cięcia można również zwiększyć poprzez wstrzykiwanie bezpośrednio do komórki. Jednak wstrzyknięcie do worka z żółtkiem jest technicznie mniej wymagające i zapewnia wystarczające cięcie, aby uzyskać ryby o wysokiej transmisji w linii zarodkowej (>70% potomstwa zawierającego zmodyfikowany allel).
13. Umieścić wstrzyknięte zarodki z powrotem na odpowiednio oznakowanej szalce Petriego, przykryć je 1x pożywką E3 z błękitem metylenowym i umieścić w inkubatorze zarodków ustawionym na 28 °C.
14. Po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf) należy sprawdzić stan zdrowia wstrzykniętych zarodków, usuwając martwe lub nieprawidłowo rozwijające się osobniki i zmieniając pożywkę (patrz ryc. 1). Sprawdzić wskaźnik przeżycia w porównaniu z kontrolą bez wstrzyknięcia.
    nuta: W przypadku celowania w nieistotny gen, oczekuje się mniej niż 10% śmiertelności w porównaniu z niewstrzykniętą kontrolą. Jeśli w populacjach, którym wstrzyknięto wstrzyknięte przewodniki, obserwuje się podwyższony poziom śmiertelności w porównaniu z kontrolą, której nie wstrzyknięto, może to oznaczać, że docelowy gen jest niezbędny do rozwoju lub efekty niezamierzone prowadzą do nieudanego rozwoju. Konieczne może być zmniejszenie ilości wstrzykiwanych odczynników CRISPR lub może być wymagane wytworzenie nowego sgRNA o zmniejszonych efektach poza celem.
15. Zwróć zarodki do inkubatora i kontynuuj wzrost zarodków do 72 hpf, codziennie zmieniając pożywkę, aby utrzymać zdrowie zarodka.

Wyniki

Rycina 1: Porównanie stanu zdrowia 24 zarodków, którym wstrzyknięto hpf. Żywy zarodek (A) rozwinięty do 24 hpf jest łatwy do odróżnienia od zarodka, który ma przerwany rozwój (B). Zarodki, które przypominają (B) lub mają drastycznie zmienione cechy (A), takie jak skrzywienie kręgosłupa lub zmieniony rozwój głowy i oczu, powinny zostać usunięte z naczynia

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Woda wolna od RNaz	Dowolna marka		Synteza przewodnikowych RNA. Thermo Fisher i Qiagen przenoszą odpowiednia woda.
Pożywki dla zarodków E3	Wyprodukowano we własnym zakresie		Pożywka do hodowli zarodków i Wykonanie płyty injeciton. Przepis: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Błękit metylenowy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M9140	Dodawany do 1x pożywki E3 w celu zapobiegania rozwojowi grzybów na zarodkach.
szalka Petriego	Rybak termiczny	FB0875711Z	Przechowywać zarodki, odlewana płytka iniekcyjna
Agarozy	Denville	Zobacz materiał CA3510-8	Odlewana płytka iniekcyjna, żele agarozowe.
Forma mikroinekcyjna	Adaptacyjne narzędzia naukowe	Samolot TU-1	Aby stworzyć studzienki do przechowywania zarodków podczas wstrzykiwania
Czerwień fenolowa	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P0290	Barwnik do wizualizacji iniekcji
olej mineralny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M5904-5ML	Kalibracja objętości wstrzyknięcia igły.
Pipety transferowe	Dowolna marka		Przenoszenie zarodków
żyletka	Rybak termiczny	Numer katalogowy 11295-10	Igła do wstrzykiwań tnących, obcinanie ogona dorosłej ryby.
inkubator			Utrzymanie zarodków w temperaturze 28,5 C.
Ściągacz do pipet pionowych	David Kopf Instrumenty	700C	Generuj igły do wstrzykiwań. Dodatkowe instrukcje ciągnięcia igły: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
Rurki kapilarne	Instrumenty Sutter	Zobacz materiał BF100-58-10 Zobacz materiał BF100-58-10	Generuj igły do wstrzykiwań.
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	930001007	Umieścić roztwór w igłach do wstrzykiwań
Mikrowtryskiwacz	Światowe instrumenty precyzyjne	PV 820	Wstrzykiwanie zarodków.
Mikroskop preparacyjny	Księga Leica		Wstrzykiwanie zarodków.
kuchenka mikrofalowa	Dowolna marka		Odlewana płytka iniekcyjna, żele agarozowe.
skala	Dowolna marka		Odlewana płytka iniekcyjna, żele agarozowe.
rękawiczki	Dowolna marka		W odniesieniu do wszystkich aspektów protokołu.
N2	Dowolna marka		Aby usunąć płyn z naczynia włosowatego do wstrzyknięcia zarodka
Probówki paskowe do PCR	Dowolna marka		W odniesieniu do wszystkich aspektów protokołu.
Końcówki 200 μL	Dowolna marka		W odniesieniu do wszystkich aspektów protokołu.
Końcówki 10 μL	Dowolna marka		W odniesieniu do wszystkich aspektów protokołu.
Mikropipety	Dowolna marka		W odniesieniu do wszystkich aspektów protokołu.