Ksenoprzeszczep danio pręgowanego od pacjenta (zPDX): model raka

Streszczenie

Źródło: Wang L. et al., Heterogeniczny model ksenoprzeszczepu raka trzustki uzyskany przez pacjenta z wykorzystaniem larw danio pręgowanego jako gospodarzy do porównawczej oceny leków. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje technikę tworzenia modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z danio pręgowanego. W protokole próbki oceniamy skuteczność leków Gemcytabina i Navitoclax na modelu ksenoprzeszczepu guza trzustki.

Protokół

1. Wstrzykiwanie zawiesiny mieszanych komórek do danio pręgowanego

1. Dodać 10x roztwór trikainy do wody E3 w celu znieczulenia larw danio pręgowanego i przenieść larwy (z kroku 2.3) na płytkę iniekcyjną wypełnioną zmodyfikowanym E3 (E3 z 1 g/l glukozy i 5 mmol/l L-glutaminy).
2. Wlać 25 μl zawiesiny z mieszanych komórek do igły do mikrokapilar i wprowadzić igłę do manipulatora do mikroiniekcji.
3. Ustaw ciśnienie i czas wtrysku. Wstrzyknij 50-80 komórek (~ 8 nL) do woreczka żółtkowego 48 hpf danio pręgowanego.

2. Hodowla ksenoprzeszczepionego danio pręgowanego (model zPDX)

1. Przenieść larwy danio pręgowanego po ksenoprzeszczepie do 40 ml roztworu mieszającego (roztwór E3 o stężeniu 1 g/l glukozy i 5 mmol/l L-glutaminy) w temperaturze 32 °C.

3. Podawanie leków na ksenoprzeszczepowanego danio pręgowanego i ocena żywotności komórek nowotworowych/fibroblastów

1. Określenie optymalnego stężenia gemcytabiny/navitoclaxu.
   1. Umieść 10 zarodków danio pręgowanego typu dzikiego w temperaturze 48 hpf w każdym dołku 12-dołkowej płytki.
   2. Dodać różne stężenia gemcytabiny lub navitoklaksu do każdego dołka i inkubować w temperaturze 32 °C przez dwa dni.
   3. Po 2 dniach należy obliczyć maksymalną dawkę tolerancji (MTD) gemcytabiny i navitoklaksu, przy której larwy danio pręgowanego nie wykazują znacznych wad rozwojowych i nieprawidłowego zachowania, a stężenia robocze ustala się poniżej MTD.
2. Leczenie modeli zPDX gemcytabiną/nawitolaksem.
   1. Umieść 10 ksenoprzeszczepionych larw w każdym dołku 12-dołkowej płytki.
   2. Podzielić larwy na cztery grupy, grupę kontrolną traktować E3 zawierającym 0,1% DMSO, a pozostałe grupy traktować 5 μg/ml gemcytabiny i/lub 50 μM nawitoklaksu i inkubować w temperaturze 32 °C przez dwa dni.
3. Ocena żywotności komórek i składu komórkowego w modelach zPDX.
   1. Po leczeniu znieczulić ksenoprzeszczepione larwy i umieścić je w 3% metylocelulozie.
   2. Zmasakruj larwy z widoku bocznego za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego.
   3. Określ ilościowo intensywność sygnałów czerwonej i zielonej fluorescencji za pomocą oprogramowania ImageJ i GraphPad.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
L-glutamina	GIBCO (Przedsiębiorstwo GIBCO)	21051024
Gemcytabina	Gemzan powiedział:
Metyloceluloza	Sigma	Zobacz materiał M0262
Navitoclax(ABT-263)	Selleck powiedział	Zobacz materiał S1001	Inhibitor Bcl-xL
sprzęt
Mikrowtryskiwacz	NARISHIGE (NARISZGIE)
Mikroskop konfokalny	LEICA (Dziennik LEICA	Dodatek SP8	0,00

TGL :