Odwrotne podejście genetyczne do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy

Naszym celem jest tutaj przetestowanie funkcjonalnej redundancji dwóch czynników transkrypcyjnych w celu określenia progenitorów kardiomiocytów. Czynniki są kodowane przez dwa powiązane geny gata5 i gata6, a my używamy modelu danio pręgowanego, aby zrozumieć ich względne funkcje¹. Nasza strategia polega na blokowaniu funkcji genów za pomocą morpholinos². Wstrzykniemy morfoliny dla jednego lub drugiego genu do zapłodnionych jaj i porównamy fenotyp embrionalny z zarodkami pochodzącymi z jaj wstrzykniętych jednocześnie z obydwoma morfolinami. Aby uprościć ocenę fenotypów, używamy jaj pochodzących od ryb, które są nosicielami transgenu wyrażającego GFP w kardiomiocytach.

Krok 1. Przygotowanie do mikroiniekcji.

A) Ustawianie par hodowlanych ryb

Wieczorem przed wstrzyknięciem, pojedyncze samce i pojedyncze samice dorosłej ryby (w wieku 3-18 miesięcy) są umieszczane w parach w zbiornikach hodowlanych oddzielonych przegrodą do następnego ranka. Zazwyczaj zakładamy 10-20 par ryb, które są kryte raz w tygodniu, niezależnie od tego, czy jaja będą używane, aby utrzymać płodność. W tym eksperymencie używamy szczepu reporterowego, transgenicznego dla cmlc2:egfp, ponieważ zapewnia prosty odczyt w celu identyfikacji różnicujących się kardiomiocytów. Następnego ranka, po włączeniu świateł, woda jest wymieniana, a przegrody są wyciągane ze zbiorników, umożliwiając parom ryb łączenie się w pary i produkcję jaj. Produkcja jaj może być monitorowana i może rozpocząć się natychmiast lub po upływie godziny lub dłużej, w zależności od ryby. Zazwyczaj, po około 20 minutach nieprzerwanego krycia, jaja są zbierane za pomocą pipety lub sitka i wlewane do 100 mm szalek Petriego zawierających wodę systemową. Ważne jest, aby monitorować produkcję jaj, aby upewnić się, że zarodki są wstrzykiwane między 1-4 komórkami. Uwalniając kilka par na raz, możliwe jest rozłożenie produkcji jaj w czasie, a tym samym maksymalizacja ilości jaj, które można wstrzyknąć we wczesnym etapie rozwoju. Dobra para ryb może wygenerować ponad 200 zarodków i nie ma praktycznego sensu zbieranie tysięcy jaj w tym samym czasie, ponieważ pojedynczy badacz nie byłby w stanie wstrzyknąć ich wystarczająco szybko, zanim rozwiną się poza stadium 4-komórkowe. Ryby są stymulowane do rozmnażania się w cyklu świetlnym, więc jest to eksperyment, który wymaga wczesnego rozpoczęcia, a jaja zwykle nie są uzyskiwane po południu.

B) Przygotowanie igieł

1. Użyj ściągacza do mikropipet i szklanej rurki kapilarnej 3,5 cala, aby wygenerować dwie igły w następujących warunkach: Ciepło = 626, Ciągnięcie = 60, Prędkość = 60 i Czas = 250. Używamy igieł z otwartym rdzeniem, które nie zawierają filamentu, ponieważ napełniamy je od przodu za pomocą ssania.
2. Końcówka każdej igły jest następnie delikatnie łamana za pomocą czystej żyletki lub kleszczy, a następnie fazowana pod kątem 30 stopni przez około 20 sekund za pomocą mikroszlifierki EG-4. Powoduje to zaostrzenie końcówki i jest ważne w przypadku wstrzykiwania przez kosmówkę.
3. Ważne jest, aby uzyskać stałą średnicę końcówki igły wynoszącą około 15 mikronów (skalibrowaną jako 4 jednostki za pomocą okularu mikroskopu z siatką, aby móc skalibrować objętość wstrzyknięcia 1-2 nl).
4. Igły powinny być przygotowane z wyprzedzeniem, bezpiecznie przechowywane w bezpiecznym miejscu, a każda z nich powinna być indywidualnie kalibrowana tuż przed rozpoczęciem wstrzyknięć, aby zapewnić stałą objętość wstrzyknięcia (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji D). Jeśli masz szczęście, możesz być w stanie użyć jednej igły do całego eksperymentu. Jednak igła może łatwo pęknąć w trakcie eksperymentu, a nie chcesz wykorzystywać tego czasu na wyciąganie nowych igieł.

C) Wykonywanie płytek iniekcyjnych

1. Przygotuj 100 ml 2% roztworu agarozy w wodzie systemowej, gotując w kuchence mikrofalowej.
2. Ostudzić w dotyku i wlać około 12 ml do odwróconej pokrywki szalki Petriego o średnicy 100 mm.
3. Włóż 2 szkiełka mikroskopowe, nachylone pod kątem około 45 stopni, do dwóch stron pokrywy. Gdy agaroza zastygnie, delikatnie odciągnij dwie szkiełka od pokrywki.
4. W ten sposób powstają koryta, w których zostaną umieszczone zarodki, a następnie wstrzyknięte. Wiele talerzy można przygotować z wyprzedzeniem. Można je przechowywać w nieskończoność w temperaturze 4°C po dodaniu warstwy 70% etanolu, dodaniu dolnej części oryginalnej płytki i uszczelnieniu parafilmem. Pamiętaj, aby dobrze umyć przed użyciem.

D) Stacja mikroiniekcji i kalibracja igły

1. Włącz źródło sprężonego azotu i mikroiniektor PLI-100. Wtryskiwacz powinien być ustawiony na stałe ciśnienie przepływu 18 PSI.
2. Przed włożeniem igły należy upewnić się, że mikromanipulator znajduje się w odpowiedniej pozycji, aby umożliwić szeroki zakres ruchu i że włożona igła nie uderzy w stół. Włóż jedną z przygotowanych wcześniej igieł (patrz rozdział C) do mikromanipulatora, upewniając się, że jest szczelnie zamknięta. Uważaj, aby nie złamać igły.
3. Obserwuj końcówkę igły pod mikroskopem, aby upewnić się, że nie jest zatkana przed przystąpieniem do kalibracji.
4. Umieścić kroplę (2-3 μl) roztworu do wstrzykiwań lub ddH₂O na małym kawałku parafilmu i napełnić około 1,5 μl, wciągając go do igły za pomocą przycisku napełniania. Upewnij się, że końcówka igły jest całkowicie zanurzona w roztworze i obserwuj zasysanie cieczy przez mikroskop, aby uniknąć wciągania pęcherzyków powietrza.
5. Umieść kroplę oleju mineralnego na siatce mikrometru.
6. Dostosuj empirycznie czas wstrzyknięcia, aby upewnić się, że wielkość kropli wynosi około 1,5 mikrona. Zapewni to objętość wstrzyknięcia ~ 1,8 nl. Rzeczywistą objętość można dostosować do własnego uznania, ale w sensie praktycznym trudno jest dokładnie skalibrować objętości poniżej 1 nl, a zarodki mogą nie tolerować objętości powyżej 2 nl. Niezależnie od wybranej objętości, należy ją zachować taką samą dla wszystkich wstrzyknięć, w tym grupy kontrolnej, i dostosować stężenie roztworu (a nie objętość wstrzyknięcia), aby miareczkować ilość wstrzykiwanego morfolino.
7. Ponowna kalibracja jest konieczna za każdym razem, gdy igła jest wymieniana, ponieważ rozmiary końcówek igieł będą się różnić.

Krok 2. Walidacja morfolinosów ukierunkowanych na dwa odrębne geny

Morfolinosy są zaprojektowane tak, aby celować w miejsce inicjacji translacji lub miejsca splicingu docelowego mRNA, blokując w ten sposób syntezę białek lub prawidłowe przetwarzanie mRNA. Analizując gen po raz pierwszy, używamy obu typów morfolinosów, aby sprawdzić, czy generują one ten sam fenotyp, wskazujący na określony knockdown. Zaletą splice-blockera jest to, że można zweryfikować knockdown normalnego transkryptu za pomocą RT-PCR, co jest szczególnie przydatne, jeśli przeciwciała dla docelowego genu nie są dostępne. Zilustrujemy, w jaki sposób uzyskuje się spójny fenotyp serca dla genów gata5 i gata6 za pomocą morpholinos (sekwencja gata5 5'UTR MO: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3'; gata5 powiedział: Sekwencja MO miejsca łączenia: 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'; gata6 5'UTR MO sekwencja: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3').

1. Morfolinosy są pozyskiwane od Gene Tools, LLC (Philomath, OR). Gene Tools pomoże Ci wybrać najlepszą sekwencję do celu, jeśli poprosisz ich personel pomocniczy. Wystarczy, że wyślesz im numer dostępu, a oni doradzą. Nie ma jednak gwarancji, że morfolino zadziała, dlatego musisz być przygotowany na walidację działania. Możesz również sprawdzić, czy morpholino jest dostępne w OpenBiosystems. Gene Tools dostarcza zapasy zsyntetyzowanych morfolinos do OpenBiosystems. Chociaż ponownie nie ma gwarancji, że to zadziała, sprzedają mniejsze ilości po niższych kosztach, co może pomóc w pokryciu kosztów testowania nowych celów. Pamiętaj, aby WYSADZIĆ swój morfolino w stosunku do transkryptomu; używamy funkcji BLAT w przeglądarce genomu zebry (genome.ucsc.edu UCSC). Oczywiście, jeśli morfolino zostało zatwierdzone (rygorystycznie) w literaturze, zaleca się zakup tej samej sekwencji.
2. Morfolino rozpuszcza się w sterylnym ddH₂0 do końcowego stężenia 1 mM i przechowuje w temperaturze pokojowej. NIE ZAMRAŻAJ roztworów morpholino, ponieważ z jakiegoś powodu niskie temperatury mogą czasami powodować ich agregację i wytrącanie. Morfoliny są niewrażliwe na proteazy lub nukleazy, więc tak długo, jak dodawana woda jest sterylna, powinny być całkiem bezpieczne w temperaturze pokojowej.
3. Przed wstrzyknięciem należy inkubować morfolino w temperaturze 65°C przez 5 minut, aby upewnić się, że jest całkowicie rozpuszczone, i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. NIE umieszczaj sample na lodzie. Morfolino należy przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu wstrzyknięcia.
4. Aby miareczkować morfolino, zwykle przygotowujemy seryjne rozcieńczenia stężenia podstawowego w ddH₂0, aby uzyskać stężenia robocze 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM i 0,125 mM. W zależności od sekwencji, przy użyciu 1,8 nl objętości wstrzyknięcia, odpowiada to około 20 ng, 10 ng, 5 ng i 2,5 ng morfolinu na wstrzyknięcie. To tylko punkt wyjścia, ponieważ tolerancja i skuteczność każdego morfolino będą się różnić i nie można ich przewidzieć. Większość morfolinosów nie będzie tolerowana znacznie powyżej 20 ng, ale niektóre mogą być skuteczne w dawkach znacznie poniżej 1 ng. Nasze podejście polega na zdefiniowaniu stężenia, przy którym fenotyp "plateaus". Innymi słowy, jeśli zdefiniowany fenotyp nie jest obserwowany przy użyciu 2,5 ng, ale jest podobny przy użyciu dowolnej ilości równej lub wyższej niż 5 ng, wybralibyśmy 5 ng jako ilość progową. Oczywiście przydatne może być następne miareczkowanie w zakresie od 2,5 ng do 5,0 ng, aby mieć pewność, że praca jest powtarzalna powyżej wartości progowej, a nie bezpośrednio "na granicy".
5. Napełnij dołączoną i skalibrowaną igłę (patrz wyżej) roztworem morfolino o najniższym stężeniu roboczym (najbardziej rozcieńczonym). Unikaj przepełniania igły, ponieważ spowoduje to po prostu marnowanie materiału. Jeśli wypełnisz tylko 1 μl, roztwór wystarczy na 500 wstrzyknięć.
6. Za pomocą jednorazowej pipety przenieś zapłodnione zarodki jednokomórkowe do koryt płytki do mikroiniekcji. Usunąć nadmiar wody, aby upewnić się, że zarodki opadną na dno koryt iniekcyjnych. Nie powinny unosić się na wodzie, ale raczej przylegać do złoża agarozy.
7. Ustawić płytkę iniekcyjną w taki sposób, aby mikromanipulator mógł opuścić końcówkę igły przez kosmówkę i do żółtka w celu wstrzyknięcia. Aby ustawić poszczególne zarodki, należy manipulować płytką iniekcyjną w taki sposób, aby końcówka igły do wstrzykiwań popychała lub przyciągała zarodki do właściwej pozycji. Uważaj, aby nie złamać końcówki igły ani nie uszkodzić zarodków! Wymaga to pewnej wprawy, ale z reguły używa się mikromanipulatora po prostu do wprowadzenia igły iniekcyjnej do zarodka, a następnie po wstrzyknięciu dość szybko i czysto na zewnątrz. Zarodki ustawia się w pozycji do wstrzyknięcia, przesuwając płytkę wolną ręką (lewą ręką w przypadku wstrzyknięcia prawą ręką). Dla nowego ucznia przydatne jest ćwiczenie z użyciem roztworu zawierającego 0,25% czerwieni fenolowej w celu wizualizacji wstrzykniętego roztworu. Pewność uzyskuje się również poprzez wstrzyknięcie roztworu zawierającego mikrosfery znakowane fluorescencyjnie (sondy molekularne; F-8794), aby potwierdzić, że roztwór został wstrzyknięty do zarodka, a nie do przestrzeni międzykosmówkowej. Jednak po kilku rundach praktyki pomoce te zazwyczaj nie są już potrzebne. Dobrym pomysłem jest od czasu do czasu wstrzykiwanie do powietrza, aby upewnić się, że igła nie jest zatkana i że wstrzykiwana objętość wydaje się odpowiednia.
8. Wstrzyknięte zarodki przenosi się z powrotem na 100-milimetrową szalkę Petriego z wodą systemową i hoduje w temperaturze 28,5C. Po wstrzyknięciu o najniższym stężeniu roboczym, wszelkie pozostałe roztwory mogą zostać wydalone, a następne najwyższe stężenie robocze morfolino użyte do wypełnienia igły. Powtórzyć te czynności dla każdego stężenia morfolino. Chociaż możliwe jest wypłukanie igły za pomocą wody, podczas testowania wyraźnego morpholino wolimy zmienić igły i ponownie skalibrować. Należy pamiętać o posiadaniu kohorty zarodków, którym nie wstrzyknięto, aby sprawdzić, czy konkretna partia zarodków była zdrowa i normalna.

Krok 3. Jednoczesna iniekcja morfolinosów w indywidualnych dawkach progowych

Celem przeprowadzonego powyżej miareczkowania było określenie dawki progowej dla każdego morfolino. W najlepszym przypadku zasadniczo 100% morfantów będzie miało określony fenotyp, jeśli docelowy gen pełni istotną funkcję. Można jednak spodziewać się pewnej zmienności z powodu artefaktów błędnego wstrzykiwania. Przy praktyce nie powinno to przekraczać 10%. Niektóre partie zarodków (w tym niewstrzyknięte grupy kontrolne) mogą nie przeżyć dobrze, w takim przypadku eksperyment może wymagać odrzucenia. Tymczasem istnieje również zmienność biologiczna, ponieważ poszczególne zarodki mogą być mniej lub bardziej tolerancyjne na knockdown. Wreszcie, niektóre morfoliny mogą po prostu nie być wystarczająco wydajne, aby osiągnąć solidne (penetrujące) nokautowanie. Jeśli fenotyp jest generowany w niewielkim odsetku zarodków, ale jest powtarzalny, warto przetestować odrębną morfolinę. Celem kolejnego eksperymentu jest ustalenie, czy obserwuje się zupełnie nowy fenotyp, gdy oba geny są celowane jednocześnie. Nie chodzi nam po prostu o wzrost odsetka zarodków o fenotypie morfantu, ale raczej o wytworzenie odrębnego fenotypu, który nie jest widoczny na poziomie progowym lub powyżej niego podczas testowania któregokolwiek z pojedynczych genów.

1. Przygotować mieszaninę kombinacji morfolinos badanych wcześniej, przy stężeniu progowym każdego pojedynczego morfolina, który wytworzył określony fenotyp. Na przykład, jeśli próg dla każdego genu wynosił 5 ng, przygotuj roztwór roboczy, który będzie zawierał 5 ng + 5 ng każdego z nich (łącznie 10 ng). Ponieważ zarodki mogą nie tolerować znacznie więcej niż 20 ng całkowitego morfolino, ważne jest, na podstawie poprzednich eksperymentów, użycie minimalnej ilości każdego z nich, która jest wystarczająca do skutecznego celowania w każdy gen.
2. Kontrole powinny obejmować zestawy zarodków, którym wstrzyknięto każdy pojedynczy morfolino w tym samym stężeniu, które zostało użyte w przypadku skojarzenia. Objętości roztworu do wstrzykiwań powinny być utrzymywane na stałym poziomie (np. 1,8 nl). Dużą zaletą stosowania szczepu reporterowego jest to, że można ocenić fenotyp (na przykład różnicowanie kardiomiocytów) w dowolnym momencie i wielokrotnie. Jeśli zarodki mają być oceniane pod kątem ekspresji genów przez hybrydyzację in situ, zarodki dopasowane do stadium i grupy kontrolne mogą być ustalane w różnych momentach po wstrzyknięciu. W naszym eksperymencie zamierzamy ocenić ekspresję GFP jako substytut różnicowania kardiomiocytów, przy około 24 hpf.

Krok 4. Ocena fenotypów

1. Zarodki, którym wstrzyknięto zarodki, powinny być monitorowane bezpośrednio po wstrzyknięciu i kilka razy w ciągu doby w celu usunięcia martwych lub umierających zarodków, ponieważ może to zagrozić żywotności pozostałych morfantów. Aby ocenić ekspresję genu reporterowego, zarodki są badane za pomocą mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w zdolność fluorescencji. Używamy mikroskopu Nikon SMZ1500, z obiektywem 1X lub 1,6X i zakresem powiększenia od 0,75x do 11,25x. Korzystając z filtra fluorescencyjnego, należy otworzyć membranę do ustawienia całkowitego otwarcia, aby zmaksymalizować natężenie światła. Upewnij się również, że używasz odpowiedniego filtra, w zależności od genu reporterowego (GFP, RFP itp.).
2. Zarodki są zazwyczaj uspokojone przy użyciu rozcieńczenia 1:20 w wodzie systemowej 4 mg/ml zapasu metanosulfonianu trikainy. Zapasy są przechowywane w stanie zamrożonym w temperaturze -20C. Alternatywnie, zarodki mogą być eutanazyjne przy użyciu 20-krotnego zapasu tricainy. Zarodki można zwykle poddać badaniom przesiewowym, nawet jeśli nadal znajdują się w kosmówce. Jednak, szczególnie jeśli będą one fotografowane, dobrym pomysłem jest usunięcie kosmówki za pomocą ostrych kleszczy. Zarodki można oglądać po umieszczeniu w szkiełkach depresyjnych w roztworze tricainy lub dla lepszego unieruchomienia ich do fotografii umieszczonej w małej kropli 3% metylocelulozy.
3. Obserwuj fenotypy zarodków u osób, którym wstrzyknięto kombinację morfolinów, w porównaniu z pojedynczymi morfantami. Tutaj szukamy wzorca ekspresji GFP w pierwotnej rurce serca. W tym szczepie reporterowym GFP ulega ekspresji wyłącznie w kardiomiocytach za pośrednictwem promotora cmlc2, co umożliwia szczegółową analizę specyfikacji serca i morfogenezy cewy sercowej.

Reprezentatywne wyniki

W naszym eksperymencie, zarówno pojedyncze morfanty gata5, jak i gata6 wykazują powtarzalne fenotypy serca po wstrzyknięciu z poziomami progowymi, chociaż istnieje znaczna zmienność biologiczna^3,4. Na przykład większość morfantów gata5 generuje dwudzielne serce, z ekspresją GFP zlokalizowaną w dwóch regionach. Dzieje się tak, ponieważ komórki progenitorowe serca nie migrują prawidłowo, aby połączyć się w linii środkowej podczas tworzenia cewy serca. Jednak niektóre morfanty gata5 generują wadliwą rurkę serca, a u niewielkiej liczby (5%) następuje znaczny spadek liczby komórek GFP+. Uważamy, że odzwierciedla to zmienność biologiczną, ale może również wynikać z faktu, że morpholinos nie są równoznaczne z mutacją "zerową".

Podobnie, wszystkie morfanty gata6 wykazują fenotyp serca, ale istnieje szereg fenotypów, w tym niewielka liczba dwuszczepowych rui i serca, które są zaburzone morfologicznie w porównaniu do niewstrzykniętych zarodków kontrolnych. Ta zmienność nie jest niczym niezwykłym w przypadku fenotypu morfogenetycznego serca, ponieważ tworzenie się serca jest procesem dynamicznym i przynajmniej część fenotypu serca może być pośrednio spowodowana embrionalnymi wadami morfogenetycznymi. Jednak, co ważne, zakres wad morfogenetycznych serca zarówno dla morfantów gata5, jak i gata6 jest spójny i powtarzalny, a w większości zarodki generują znaczne kardiomiocyty GFP+.

W przeciwieństwie do pojedynczych morfantów gata5 i gata6, zarodki pozbawione obu czynników wykazują całkowitą utratę ekspresji GFP, co jest zgodne z utratą kardiomiocytów. Tak więc gata5 i gata6 mają nieredundantne funkcje morfogenezy serca, ale te dwa geny są funkcjonalnie redundantne w wymaganiu do generowania zróżnicowanych kardiomiocytów. Nasze wcześniejsze badania wykazały również utratę najwcześniejszych markerów kardiomiocytów, w tym nkx2,5, co sugeruje wymóg specyfikacji kardiomiocytów³.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.