Funkcja genu może zostać zamaskowana w eksperymentach polegających na utracie funkcji, jeśli następuje kompensacja przez inny gen. Model rybki danio (zebrafish) zapewnia relatywnie wysokoprzepustowy sposób ujawniania takiej redundancji funkcjonalnej w żywych embrionach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podejście genetyki odwrotnej do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Funkcja genów podczas embriogenezy jest zazwyczaj definiowana za pomocą eksperymentów polegających na utracie funkcji, na przykład poprzez celowaną mutogenezę (knockout) u myszy. W modelu danio pręgowanego opracowano skuteczne techniki genetyki odwrotnej z wykorzystaniem mikroiniekcji specyficznych dla danego genu antysensownych morfolino. Morfolino wiążą się z mRNA poprzez specyficzne parowanie zasad i przejściowo blokują funkcję genu, hamując translację lub splicing przez kilka dni podczas embriogenezy (knockdown). Jednak u kręgowców, takich jak mysz czy danio pręgowany, niektóre funkcje genów mogą zostać zamaskowane przez te podejścia ze względu na obecność innego genu, który kompensuje tę stratę. Dotyczy to szczególnie rodzin genów zawierających geny siostrzane, które są współwyrażane w tych samych rozwijających się tkankach. U danio pręgowanego kompensację funkcjonalną można przetestować w sposób stosunkowo wysokoprzepustowy poprzez ko-iniekcję morfolino, które jednocześnie celują w knockdown obu genów. Podobnie, z wykorzystaniem morfolino można wykazać interakcję genetyczną między dowolnymi dwoma genami poprzez jednoczesny knockdown obu genów na poziomach poniżej progu. Na przykład morfolino można miareczkować tak, aby żaden z indywidualnych knockdownów nie generował fenotypu. Jeśli w tych warunkach ko-iniekcja obu morfolino wywołuje fenotyp, wykazano interakcję genetyczną. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak wykazać redundancję funkcjonalną w kontekście dwóch powiązanych czynników transkrypcyjnych GATA. Czynniki GATA są niezbędne do specyfikacji progenitorów serca, ale ujawnia się to jedynie po utracie zarówno Gata5, jak i Gata6. Pokazujemy, jak przeprowadzić eksperymenty z mikroiniekcji, zwalidować morfolino oraz ocenić skompensowany fenotyp w procesie kardiogenezy.
Protokół
Naszym celem jest tutaj przetestowanie funkcjonalnej redundancji dwóch czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za specyfikację progenitorów kardiomiocytów. Czynniki te są kodowane przez dwa powiązane geny gata5 oraz gata6, a do zrozumienia ich względnych funkcji wykorzystujemy model ryby danio1. Nasza strategia polega na zablokowaniu funkcji genów przy użyciu morfolin2. Wprowadzimy za pomocą zastrzyków morfoliny dla jednego lub drugiego genu do zapłodnionych jaj, a następnie porównamy fenotyp embrionalny z embrionami pochodzącymi z jaj, do których jednocześnie wstrzyknięto obie morfoliny. Aby uprościć ocenę fenotypów, stosuj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W opisanym tutaj eksperymencie połączyliśmy dwa morfolino, z których każde z osobna wywołuje odmienny zakres fenotypów, i zaobserwowaliśmy całkowicie inny fenotyp po ich wspólnej iniekcji. Oczywiście, w pierwszej kolejności potrzebowaliśmy uzasadnienia dla przeprowadzenia tego badania. Podejrzewaliśmy, że dwa geny mogą wzajemnie kompensować swoją funkcję na wcześniejszym etapie, w tym przypadku podczas specyfikacji serca. Wynika to z faktu, że geny te są blisko spokrewnione (i zdolne do wiązania się z tymi samymi sekwenc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy członkom laboratorium Evansa za pomoc w przygotowaniu tej prezentacji. Morfolino wykorzystane w tej pracy zostały pierwotnie zwalidowane przez dr Audrey Holtzinger. T.E. otrzymuje wsparcie finansowe z grantów National Institutes of Health (HL064282 i HL056182). Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Institute for Animal Care and Use Committee w Weill Cornell Medical College.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zbiorniki i przegrody do hodowli ryb | Aquatic Habitats | ||
| Siatki do ryb | Aquatic Habitats | ||
| Woda systemowa | 60mg Instant Ocean” na litr dH2O | ||
| 100mm szalki Petriego | BD Biosciences | 351029 | |
| Wytciągacz igieł do mikropipet | Sutter Instrument Co. | P-97 Flaming/Brown | |
| 3.5" kapilary szklane | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Żyletka | Personna Medical Care | 94-120-71 | |
| Mikroszlifierka | Narishige International | EG-4 | |
| Siatkowy okular mikroskopowy | Premiere | MF-02 | |
| Mikrometr | WARD’s Natural Science | 94 W 9910 | |
| Agaroza ultra czysta | Invitrogen | 15510-027 | |
| Spatułka | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Waga | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | |
| Jednorazowe naczynia wagowe | Fisher Scientific | 2-202-B | |
| Konwencjonalna kuchenka mikrofalowa | GE Healthcare | ||
| Kolba Erlenmeyera | Corning | 4980 | |
| Przedmioty szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-552 | |
| cylinder miarowy | Fisher Scientific | 08-572-6D | |
| Automatyczna pipeta | BrandTech | 2026333 | |
| 70% roztwór płuczący etanolu | Tarr | 801VWR | |
| Butla N2 | Tech Air | ||
| Mikrowstrzykiwacz | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Mikromanipulator | Micro Instruments | LTD | |
| Mikroskop sekcyjny | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Parafilm | American National Can | PM-992 | |
| Olej mineralny | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| morpholino miejsca splicingu gata5 | Genetools, LLC | 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’ | |
| Bloker ATG gata5 | Genetools, LLC | 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’ | |
| Bloker ATG długiej izoformy gata6 | Genetools, LLC | 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’ | |
| Jednorazowa pipeta Pasteura | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Metanosulfonian trikainy | Argent Labs | MS-222 | |
| Metyloceluloza | ICN Biomedicals | 155495 | |
| Blok grzejny | Fisher Scientific | 11-718-4 | |
| Ostre pęsety | Dumont | Rozmiar 55 | |
| Mikroszkiełka z wgłębieniem | VWR international | 48339-009 |
Bibliografia
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
