Podejście genetyki odwrotnej do badania redundancji funkcjonalnej podczas embriogenezy

Podsumowanie

Funkcja genu może zostać zamaskowana w eksperymentach polegających na utracie funkcji, jeśli następuje kompensacja przez inny gen. Model rybki danio (zebrafish) zapewnia relatywnie wysokoprzepustowy sposób ujawniania takiej redundancji funkcjonalnej w żywych embrionach.

Streszczenie

Funkcja genów podczas embriogenezy jest zazwyczaj definiowana za pomocą eksperymentów polegających na utracie funkcji, na przykład poprzez celowaną mutogenezę (knockout) u myszy. W modelu danio pręgowanego opracowano skuteczne techniki genetyki odwrotnej z wykorzystaniem mikroiniekcji specyficznych dla danego genu antysensownych morfolino. Morfolino wiążą się z mRNA poprzez specyficzne parowanie zasad i przejściowo blokują funkcję genu, hamując translację lub splicing przez kilka dni podczas embriogenezy (knockdown). Jednak u kręgowców, takich jak mysz czy danio pręgowany, niektóre funkcje genów mogą zostać zamaskowane przez te podejścia ze względu na obecność innego genu, który kompensuje tę stratę. Dotyczy to szczególnie rodzin genów zawierających geny siostrzane, które są współwyrażane w tych samych rozwijających się tkankach. U danio pręgowanego kompensację funkcjonalną można przetestować w sposób stosunkowo wysokoprzepustowy poprzez ko-iniekcję morfolino, które jednocześnie celują w knockdown obu genów. Podobnie, z wykorzystaniem morfolino można wykazać interakcję genetyczną między dowolnymi dwoma genami poprzez jednoczesny knockdown obu genów na poziomach poniżej progu. Na przykład morfolino można miareczkować tak, aby żaden z indywidualnych knockdownów nie generował fenotypu. Jeśli w tych warunkach ko-iniekcja obu morfolino wywołuje fenotyp, wykazano interakcję genetyczną. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak wykazać redundancję funkcjonalną w kontekście dwóch powiązanych czynników transkrypcyjnych GATA. Czynniki GATA są niezbędne do specyfikacji progenitorów serca, ale ujawnia się to jedynie po utracie zarówno Gata5, jak i Gata6. Pokazujemy, jak przeprowadzić eksperymenty z mikroiniekcji, zwalidować morfolino oraz ocenić skompensowany fenotyp w procesie kardiogenezy.

Protokół

Naszym celem jest tutaj przetestowanie funkcjonalnej redundancji dwóch czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za specyfikację progenitorów kardiomiocytów. Czynniki te są kodowane przez dwa powiązane geny gata5 oraz gata6, a do zrozumienia ich względnych funkcji wykorzystujemy model ryby danio¹. Nasza strategia polega na zablokowaniu funkcji genów przy użyciu morfolin². Wprowadzimy za pomocą zastrzyków morfoliny dla jednego lub drugiego genu do zapłodnionych jaj, a następnie porównamy fenotyp embrionalny z embrionami pochodzącymi z jaj, do których jednocześnie wstrzyknięto obie morfoliny. Aby uprościć ocenę fenotypów, stosujemy jaja pochodzące od ryb niosących transgen, który ekspresuje GFP w kardiomiocytach.

Krok 1. Przygotowanie do mikroiniekcji.

A) Dobieranie par hodowlanych ryb

Wieczorem przed iniekcją pojedyncze dorosłe ryby męskie i żeńskie (w wieku od 3 do 18 miesięcy) umieszcza się parami w zbiornikach hodowlanych, rozdzielając je przegrodą do następnego ranka. Zazwyczaj przygotowujemy 10–20 par ryb, które są łączone raz w tygodniu, niezależnie od tego, czy jaja zostaną wykorzystane, aby utrzymać płodność. W tym doświadczeniu stosujemy linię reporterową, transgeniczną dla cmlc2:egfp, ponieważ zapewnia ona prosty odczyt pozwalający zidentyfikować różnicujące się kardiomiocyty. Następnego ranka, po zapaleniu światła, wymienia się wodę i wyjmuje przegrody ze zbiorników, co pozwala parom ryb na rozród i złożenie jaj. Produkcja jaj może być monitorowana; może rozpocząć się natychmiast lub po godzinie bądź dłużej, w zależności od osobników. Zazwyczaj po około 20 minutach niezakłóconego rozrodu jaja zbiera się za pomocą pipety lub sitka i przelewa do szalek Petriego o średnicy 100 mm zawierających wodę systemową. Ważne jest monitorowanie produkcji jaj, aby zapewnić wykonanie iniekcji w embrionach na etapie od 1 do 4 komórek. Poprzez uwalnianie kilku par jednocześnie można rozłożyć w czasie produkcję jaj, a tym samym zmaksymalizować liczbę jaj, które można zainiekować na wczesnym etapie rozwoju. Dobra para ryb może wytworzyć ponad 200 embrionów i nie ma praktycznego sensu zbierania tysięcy jaj w tym samym czasie, ponieważ pojedynczy badacz nie byłby w stanie zainiekować ich wystarczająco szybko, zanim rozwiną się poza etap 4 komórek. Ryby są stymulowane do rozrodu cyklem świetlnym, dlatego jest to eksperyment wymagający wczesnego rozpoczęcia, a jaj zazwyczaj nie pozyskuje się po południu.

B) Przygotowanie igieł

1. Użyj wyciągarki do mikropipet (Micropipette Puller) oraz szklanej rurki kapilarnej o długości 3,5", aby wytworzyć dwie igły przy następujących parametrach: Heat=626, Pull=60, Velocity=60 oraz Time=250. Stosujemy igły z otwartym rdzeniem, które nie zawierają włókna, ponieważ napełniamy je od przodu za pomocą ssania.
2. Końcówkę każdej igły należy delikatnie przełamać za pomocą czystego ostrza żyletki lub pęsety, a następnie sfazować pod kątem 30 stopni przez około 20 sekund przy użyciu mikro-szlifierki EG-4. Pozwala to na zaostrzenie końcówki, co jest istotne w przypadku iniekcji przez chorion.
3. Ważne jest uzyskanie powtarzalnej średnicy końcówki igły wynoszącej około 15 micron (kalibrowanej jako 4 jednostki przy użyciu okularu mikroskopowego z siatką, aby umożliwić kalibrację objętości iniekcji rzędu 1-2 nl).
4. Igły należy przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w bezpiecznym miejscu; każdą z nich kalibruje się indywidualnie bezpośrednio przed rozpoczęciem iniekcji, aby zapewnić stałą objętość wstrzykiwanego roztworu (szczegóły w sekcji D). Przy odrobinie szczęścia można użyć jednej igły do całego eksperymentu. Jednak igła może łatwo pęknąć w trakcie badania, dlatego nie należy poświęcać czasu na wyciąganie nowych igieł w trakcie pracy.

C) Przygotowanie płytek do iniekcji

1. Przygotować 100 ml 2% roztworu agarozy w wodzie systemowej, gotując go w kuchence mikrofalowej.
2. Ostudzić do temperatury bezpiecznej w dotyku i wlać około 12 ml do odwróconej pokrywy szalki Petriego o średnicy 100 mm.
3. Wsunąć 2 szkiełka przedmiotowe, pod kątem około 45 stopni, po obu stronach pokrywy. Po zestaleniu się agarozy delikatnie odsunąć oba szkiełka od pokrywy.
4. W ten sposób powstają rowki, w których zostaną umieszczone, a następnie poddane iniekcji embriony. Można przygotować wiele płytek z wyprzedzeniem. Można je przechowywać w nieskończoność w temperaturze 4°C po dodaniu warstwy 70% etanolu, przykryciu dnem oryginalnej szalki i uszczelnieniu parafilmem. Pamiętać o dokładnym wypłukaniu przed użyciem.

D) Stanowisko do mikroiniekcji i kalibracja igły

1. Włącz źródło sprężonego azotu oraz mikroinjektor PLI-100. Injektor należy ustawić na stałe ciśnienie przepływu 18 PSI.
2. Przed włożeniem igły upewnij się, że mikromanipulator znajduje się w odpowiedniej pozycji, aby zapewnić szeroki zakres ruchu i zapobiec uderzeniu włożonej igły o stół. Włóż jedną z wcześniej przygotowanych igieł (patrz sekcja C) do mikromanipulatora, dbając o szczelne dopasowanie. Zachowaj ostrożność, aby nie złamać igły.
3. Przed przystąpieniem do kalibracji obejrzyj końcówkę igły pod mikroskopem, aby upewnić się, że nie jest zapchana.
4. Nanieś kroplę (2-3 μl) roztworu do iniekcji lub ddH₂O na mały kawałek paraf filmu i pobierz około 1,5 μl, wciągając ciecz do igły za pomocą przycisku napełniania. Upewnij się, że końcówka igły jest całkowicie zanurzona w roztworze, i obserwuj zasysanie cieczy przez mikroskop, aby uniknąć zaciągnięcia pęcherzyków powietrza.
5. Nanieś kroplę oleju mineralnego na siatkę mikrometru.
6. Dopasuj empirycznie czas iniekcji tak, aby średnica kropli wynosiła około 1,5 mikrona. Pozwoli to na podanie objętości iniekcji rzędu ~ 1,8 nl. Faktyczną objętość można dostosować według uznania, jednak w praktyce trudno jest precyzyjnie skalibrować objętości poniżej 1 nl, a zarodki mogą nie tolerować objętości powyżej 2 nl. Niezależnie od wybranej objętości, zachowaj ją taką samą dla wszystkich iniekcji, w tym dla kontroli, a stężenia roztworów dostosuj (zamiast objętości iniekcji), aby miareczkować ilość wstrzykiwanego morpholino.
7. Ponowna kalibracja jest konieczna przy każdej wymianie igły, ponieważ rozmiary końcówek igieł mogą się różnić.

Krok 2. Walidacja morfolinów skierowanych przeciwko dwóm różnym genom

Morfolino są zaprojektowane tak, aby celować w miejsce inicjacji translacji lub miejsca splicingowe docelowego mRNA, blokując w ten sposób syntezę białka lub prawidłowe przetwarzanie mRNA. Analizując gen po raz pierwszy, stosujemy oba rodzaje morfolino, aby sprawdzić, czy wywołują one ten sam fenotyp, co wskazuje na specyficzny knockdown. Zaletą blokera splicingu jest możliwość weryfikacji knockdownu prawidłowego transkryptu za pomocą RT-PCR, co jest szczególnie użyteczne w przypadku braku dostępnych przeciwciał dla badanego genu. Zilustrujemy, w jaki sposób uzyskano spójny fenotyp kardiologiczny dla genów gata5 i gata6 przy użyciu morfolino (sekwencja MO 5'UTR gata5: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3'; sekwencja MO miejsca splicingu gata5: 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'; sekwencja MO 5'UTR gata6: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3').

1. Morfolino uzyskuje się z firmy Gene Tools, LLC (Philomath, OR). Personel wsparcia Gene Tools pomoże w wyborze najlepszej sekwencji docelowej na prośbę użytkownika. Wystarczy przesłać numer akcesyjny, a firma udzieli odpowiednich zaleceń. Nie ma jednak gwarancji, że morfolino będzie skuteczne, dlatego należy być przygotowanym do walidacji jego aktywności. Można również sprawdzić dostępność morfolino w firmie OpenBiosystems. Gene Tools dostarcza zsyntetyzowane zapasy morfolino do OpenBiosystems. Ponownie, nie ma gwarancji skuteczności, jednak firma ta sprzedaje mniejsze ilości w niższej cenie, co może pomóc w obniżeniu kosztów testowania nowych celów. Należy przeprowadzić analizę BLAST sekwencji morfolino w odniesieniu do transkryptomu; stosujemy do tego funkcję BLAT w przeglądarce genomu danio pręgowanego UCSC (genome.ucsc.edu). Oczywiście, jeśli dana sekwencja morfolino została (rygorystycznie) zwalidowana w literaturze, zaleca się zakup tej samej sekwencji.
2. Morfolino rozpuszcza się w sterylnej wodzie ddH₂0 do stężenia końcowego 1 mM i przechowuje w temperaturze pokojowej. NIE WOLNO ZAMRAŻAĆ roztworów morfolino, ponieważ z pewnych przyczyn niskie temperatury mogą czasami powodować ich agregację i wytrącanie się. Morfolino są niewrażliwe na proteazy i nukleazy, więc dopóki dodawana woda jest sterylna, powinny być one bezpieczne w temperaturze pokojowej.
3. Przed wstrzyknięciem należy inkubować morfolino w temperaturze 65°C przez 5 minut, aby upewnić się, że jest całkowicie rozpuszczone, a następnie pozwolić mu ostygnąć do temperatury pokojowej. NIE NALEŻY umieszczać próbki na lodzie. Morfolino należy przechowywać w temperaturze pokojowej aż do momentu wstrzykiwania.
4. Aby miareczkować morfolino, zazwyczaj przygotowujemy rozcieńczenia szeregowe stężenia zapasowego w ddH₂0, aby uzyskać stężenia robocze 1 mM, 0.5 mM, 0.25 mM i 0.125mM. W zależności od sekwencji, przy objętości wstrzyknięcia 1.8 nl, odpowiada to w przybliżeniu 20ng, 10ng, 5ng i 2.5ng morfolino na jedno wstrzyknięcie. Jest to jedynie punkt wyjścia, ponieważ tolerancja i skuteczność każdego morfolino są różne i nie można ich przewidzieć. Większość morfolino nie jest tolerowana w dawkach znacznie przekraczających 20 ng, ale niektóre mogą być skuteczne przy dawkach znacznie poniżej 1 ng. Nasze podejście polega na określeniu stężenia, przy którym fenotyp osiąga „plateau”. Innymi słowy, jeśli określony fenotyp nie występuje przy 2.5 ng, ale jest podobny przy każdej ilości równej lub większej niż 5 ng, przyjmujemy 5 ng jako dawkę progową. Oczywiście warto następnie przeprowadzić miareczkowanie między 2.5 ng a 5.0 ng, aby upewnić się, że wyniki są powtarzalne powyżej progu, a nie znajdują się bezpośrednio „na granicy”.
5. Napełnić dołączoną i skalibrowaną igłę (patrz wyżej) roztworem morfolino o najniższym stężeniu roboczym (najbardziej rozcieńczonym). Należy unikać przepełniania igły, aby nie marnować materiału. Napełnienie igły ilością 1 μl zapewnia wystarczającą ilość roztworu na 500 wstrzyknięć.
6. Za pomocą jednorazowej pipety przenieść zapłodnione embriony jednokomórkowe do korytek płytki do mikroiniekcji. Usunąć nadmiar wody, aby embriony opadły na dno korytek iniekcyjnych. Nie powinny one pływać, lecz przylegać do podłoża agarowego.
7. Ustawić płytkę iniekcyjną tak, aby mikromanipulator mógł wprowadzić końcówkę igły przez chorion do żółtka w celu wstrzyknięcia. Aby ustawić poszczególne embriony, należy przesuwać płytkę iniekcyjną tak, aby końcówka igły iniekcyjnej pchała lub przyciągała embriony do właściwej pozycji. Należy uważać, aby nie złamać końcówki igły ani nie uszkodzić embrionów! Wymaga to wprawy, ale zasadniczo mikromanipulatora używa się jedynie do wprowadzenia igły iniekcyjnej do embrionu, a następnie, po wstrzyknięciu, do szybkiego i czystego jej wycofania. Embriony ustawia się w pozycji do iniekcji, przesuwając płytkę wolną ręką (lewą, jeśli wstrzykuje się prawą ręką). Dla osób początkujących przydatne jest ćwiczenie z użyciem roztworu zawierającego 0.25% czerwieni fenolowej w celu wizualizacji wstrzykniętego roztworu. Pewność można również zdobyć, wstrzykując roztwór zawierający mikrosfery znakowane fluorescencyjnie (Molecular Probes; F-8794), aby potwierdzić, że roztwór został wstrzyknięty do embrionu, a nie do przestrzeni międzychorionowej. Jednak po kilku rundach ćwiczeń takie pomoce zazwyczaj nie są już wymagane. Dobrym pomysłem jest okazjonalne wstrzykiwanie „w powietrze”, aby potwierdzić, że igła nie jest zapchana, a wstrzykiwana objętość wydaje się odpowiednia.
8. Wstrzyknięte embriony przenosi się z powrotem do 100mm szalki Petriego z wodą systemową i inkubuje w temperaturze 28.5C. Po wstrzyknięciu najniższego stężenia roboczego, pozostały roztwór można usunąć, a igłę napełnić kolejnym, wyższym stężeniem roboczym morfolino. Czynność tę powtarza się dla każdego stężenia morfolino. Choć możliwe jest wypłukanie igły wodą, przy testowaniu innego morfolino preferujemy wymianę igieł i ponowną kalibrację. Należy zachować grupę kontrolną nie wstrzykniętych embrionów, aby zweryfikować, czy dana partia embrionów była zdrowa i prawidłowo rozwijała się.

Krok 3. Współwstrzykiwanie morfolin w indywidualnych dawkach progowych

Celem przeprowadzonego powyżej miareczkowania było określenie dawki progowej dla każdego morpholino. W optymalnym scenariuszu, jeśli celowany gen pełni istotną funkcję, u niemal 100% morphantów wystąpi zdefiniowany fenotyp. Należy jednak spodziewać się pewnej zmienności wynikającej z artefaktów związanych z błędną injekcją. Przy odpowiedniej praktyce nie powinna ona przekraczać 10%. Niektóre partie embrionów (w tym kontrole nieinjektowane) mogą wykazywać niską przeżywalność, w takim przypadku eksperyment może wymagać odrzucenia. Jednocześnie istnieje zmienność biologiczna, ponieważ poszczególne embriony mogą być w różnym stopniu tolerancyjne na knockdown. Wreszcie niektóre morpholino mogą okazać się niewystarczająco wydajne, aby osiągnąć silny (penetrujący) knockdown. Jeśli fenotyp występuje u niewielkiego odsetka embrionów, ale jest powtarzalny, warto rozważyć przetestowanie innego morpholino. Celem kolejnego eksperymentu jest ustalenie, czy pojawi się całkowicie nowy fenotyp w przypadku jednoczesnego celowania w oba geny. Nie szukamy jedynie zwiększenia odsetka embrionów wykazujących fenotyp morphanta, lecz powstania odrębnego fenotypu, którego nie obserwuje się na poziomie progowym lub powyżej niego podczas testowania każdego z genów osobno.

1. Przygotować mieszaninę kombinacji morfolino przetestowanych wcześniej, w stężeniach progowych dla każdego pojedynczego morfolino, które wygenerowało określony fenotyp. Na przykład, jeśli próg dla każdego genu wynosił 5 ng, należy przygotować roztwór roboczy zawierający 5 ng + 5 ng każdego z nich (łącznie 10 ng). Ponieważ embriony mogą nie tolerować dawki przekraczającej 20 ng morfolino w sumie, ważne jest, aby w oparciu o wcześniejsze eksperymenty użyć minimalnej ilości każdego z nich, która jest wystarczająca do efektywnego celowania w każdy gen.
2. Kontrole powinny obejmować zestawy embrionów wstrzykniętych każdym pojedynczym morfolino osobno, w tym samym stężeniu, które zastosowano dla kombinacji. Objętości roztworu do wstrzykiwania powinny pozostać stałe (np. 1.8 nl). Dużą zaletą stosowania szczepu reporterowego jest możliwość oceny fenotypu (na przykład różnicowania kardiomiocytów) w dowolnym czasie i wielokrotnie. Jeśli embriony mają zostać poddane ocenie ekspresji genów za pomocą hybrydyzacji in situ, embriony i kontrole na tym samym etapie rozwoju można utrwalić w różnych odstępach czasu po wstrzyknięciu. W naszym eksperymencie ocenimy ekspresję GFP jako wskaźnik różnicowania kardiomiocytów, mniej więcej w 24 hpf.

Krok 4. Ocena fenotypów

1. Wstrzyknięte embriony należy monitorować bezpośrednio po iniekcji oraz kilka razy w ciągu dnia, aby usunąć wszystkie martwe lub obumierające osobniki, ponieważ mogą one negatywnie wpłynąć na żywotność pozostałych morfantów. W celu oceny ekspresji genu reporterowego embriony bada się przy użyciu mikroskopu stereoskopowego z możliwością obrazowania fluorescencyjnego. Stosujemy mikroskop Nikon SMZ1500 z obiektywem 1X lub 1.6X i zakresem powiększenia od 0.75x do 11.25x. Podczas korzystania z filtra fluorescencyjnego należy upewnić się, że przysłona jest całkowicie otwarta, aby zmaksymalizować intensywność światła. Należy również dobrać odpowiedni filtr, w zależności od zastosowanego genu reporterowego (GFP, RFP itp.).
2. Embriony zazwyczaj seduje się, stosując 1/20 rozcieńczenie w wodzie systemowej roztworu treściwego tricainu metanosulfonianu o stężeniu 4mg/ml. Roztwory treściwe przechowuje się w zamrażarce w temperaturze -20C. Alternatywnie embriony można uśmiercić, stosując 20-krotny roztwór treściwy tricainu. Przesiew embrionów jest zazwyczaj możliwy nawet wtedy, gdy znajdują się one jeszcze w chorionie. Jednakże, szczególnie w przypadku planowania fotografii, zaleca się usunięcie chorionów za pomocą ostrych pęset. Embriony można obserwować po umieszczeniu na szkiełkach z wgłębieniem w roztworze tricainu lub, aby lepiej je unieruchomić do zdjęć, w małej kropli 3% metylocelulozy.
3. Należy obserwować fenotypy embrionów wstrzykniętych kombinacją morfolino w porównaniu do pojedynczych morfantów. W tym przypadku analizujemy wzorzec ekspresji GFP w pierwotnej rurce serca. W tej linii reporterowej GFP jest eksprymowane wyłącznie w kardiomiocytach za pomocą promotora cmlc2, co pozwala na szczegółową analizę specyfikacji kardiologicznej oraz morfogenezy rurki serca.

Reprezentatywne wyniki

W naszym eksperymencie zarówno pojedyncze morfanty gata5, jak i gata6 wykazują powtarzalne fenotypy serca po wstrzyknięciu dawek progowych, choć występuje znaczna zmienność biologiczna^3,4. Na przykład większość morfantów gata5 wykształca serce dwudzielne, z ekspresją GFP zlokalizowaną w dwóch obszarach. Dzieje się tak, ponieważ progenitory serca nie migrują prawidłowo, aby połączyć się w linii środkowej podczas formowania rurki serca. Jednakże niektóre morfanty gata5 wykształcają wadliwą rurkę serca, a u niewielkiej liczby z nich (5%) obserwuje się znaczny spadek liczby komórek GFP+. Uważamy, że odzwierciedla to zmienność biologiczną, ale może to być również spowodowane faktem, że morfolino nie są równoważne mutacji „null”.

Podobnie, wszystkie morfanty gata6 wykazują fenotyp kardiologiczny, jednak obserwuje się cały szereg fenotypów, w tym niewielką liczbę dwudzielnych serc oraz serca o zaburzonej morfologii w porównaniu z nieiniekcyjnymi embrionami kontrolnymi. Taka zmienność nie jest nietypowa dla fenotypu morfogenetycznego serca, ponieważ jego formowanie jest procesem dynamicznym, a co najmniej część fenotypu serca może wynikać pośrednio z embrionalnych defektów morfogenetycznych. Niemniej jednak, co istotne, zakres defektów morfogenetycznych serca dla morfantów zarówno gata5, jak i gata6 jest spójny i powtarzalny, a w większości przypadków embriony wytwarzają znaczną liczbę kardiomiocytów GFP+.

W wyraźnym przeciwieństwie do pojedynczych morfantów gata5 i gata6, embriony pozbawione obu czynników wykazują całkowity zanik ekspresji GFP, co jest zgodne z utratą kardiomiocytów. Zatem gata5 i gata6 pełnią nieredundantne funkcje w morfogenezie serca, jednak oba geny są funkcjonalnie redundantne w kontekście wymogu generowania zróżnicowanych kardiomiocytów. Nasze poprzednie badania wykazały również utratę najwcześniejszych markerów kardiomiocytów, w tym nkx2.5, co sugeruje wymóg specyfikacji kardiomiocytów³.

Dyskusja

W opisanym tutaj eksperymencie połączyliśmy dwa morfolino, z których każde z osobna wywołuje odmienny zakres fenotypów, i zaobserwowaliśmy całkowicie inny fenotyp po ich wspólnej iniekcji. Oczywiście, w pierwszej kolejności potrzebowaliśmy uzasadnienia dla przeprowadzenia tego badania. Podejrzewaliśmy, że dwa geny mogą wzajemnie kompensować swoją funkcję na wcześniejszym etapie, w tym przypadku podczas specyfikacji serca. Wynika to z faktu, że geny te są blisko spokrewnione (i zdolne do wiązania się z tymi samymi sekwenc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zbiorniki i przegrody do hodowli ryb	Aquatic Habitats
Siatki do ryb	Aquatic Habitats
Woda systemowa			60mg Instant Ocean” na litr dH2O
100mm szalki Petriego	BD Biosciences	351029
Wytciągacz igieł do mikropipet	Sutter Instrument Co.	P-97 Flaming/Brown
3.5" kapilary szklane	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
Żyletka	Personna Medical Care	94-120-71
Mikroszlifierka	Narishige International	EG-4
Siatkowy okular mikroskopowy	Premiere	MF-02
Mikrometr	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Agaroza ultra czysta	Invitrogen	15510-027
Spatułka	Fisher Scientific	14-357Q
Waga	Mettler Toledo	AB54-S/FACT
Jednorazowe naczynia wagowe	Fisher Scientific	2-202-B
Konwencjonalna kuchenka mikrofalowa	GE Healthcare
Kolba Erlenmeyera	Corning	4980
Przedmioty szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-552
cylinder miarowy	Fisher Scientific	08-572-6D
Automatyczna pipeta	BrandTech	2026333
70% roztwór płuczący etanolu	Tarr	801VWR
Butla N2	Tech Air
Mikrowstrzykiwacz	Harvard Apparatus	PLI-100
Mikromanipulator	Micro Instruments	LTD
Mikroskop sekcyjny	Nikon Instruments	SMZ1500
Parafilm	American National Can	PM-992
Olej mineralny	Sigma-Aldrich	M5904
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	34155
morpholino miejsca splicingu gata5	Genetools, LLC		5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’
Bloker ATG gata5	Genetools, LLC		5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’
Bloker ATG długiej izoformy gata6	Genetools, LLC		5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’
Jednorazowa pipeta Pasteura	Fisher Scientific	13-678-20B
Metanosulfonian trikainy	Argent Labs	MS-222
Metyloceluloza	ICN Biomedicals	155495
Blok grzejny	Fisher Scientific	11-718-4
Ostre pęsety	Dumont		Rozmiar 55
Mikroszkiełka z wgłębieniem	VWR international	48339-009