Sekcja mózgu danio pręgowanego: technika neurobiologii ryb

Streszczenie

Źródło: Lopez-Ramirez M. A. et al., Izolacja i hodowla neurosfer mózgowych dorosłych danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film opisuje technikę mikrodysekcji mózgu dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta pomaga w uzyskaniu neuorosfer pochodzących z całego mózgu, które można dalej badać.

Protokół

1. Sekcja mózgu dorosłego danio pręgowanego

1. Przygotować łoże preparacyjne, wypełniając szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm żelowymi okładami z lodu. Następnie przykryć pokrywką szalkę Petriego i inkubować w temperaturze -20 °C, aż żel zamarznie. Na pokrywie umieść kwadrat czystej bibuły filtracyjnej i owiń zarówno bibułę filtracyjną, jak i szalkę Petriego folią z tworzywa sztucznego.
2. Przed każdym użyciem wyczyść i wysterylizuj wszystkie narzędzia do mikrodysekcji za pomocą 70% etanolu lub ciepła. Umieść wszystkie wysterylizowane narzędzia preparacyjne w pobliżu mikroskopu preparacyjnego i tuż przed eutanazją umieść łóżko sekcyjne pod mikroskopem z oświetleniem światłowodowym.
3. Zbierz 2 dorosłe rybki danio pręgowane, aby przygotować neurosferę całego mózgu, oraz 3 do 4 danio pręgowanego, aby wygenerować neurosfery z wypreparowanych obszarów mózgu.
4. Poddaj eutanazji dorosłego danio pręgowanego (w wieku 8-12 miesięcy) przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt. Następnie zanurz rybę w 75% etanolu na 5-10 sekund i szybko umieść w łożu preparacyjnym, a następnie zdekapitalizuj na poziomie skrzeli za pomocą ostrza chirurgicznego.
   1. Aby poddać zwierzęta eutanazji, należy podać przedawkowanie (300 mg/l) metanosulfonianu trikainy, aż bicie serca zwierzęcia stopniowo zwolni i zatrzyma się krążenie, a następnie zanurz w lodowatej wodzie.
5. Odwróć głowę grzbietową stroną do dołu i za pomocą nożyczek wykonaj podłużne cięcie od strony cięcia do ust. Za pomocą kleszczy odsłoń podstawę czaszki i usuń całą przylegającą tkankę. Przetnij boczne ściany czaszki od początku rdzenia kręgowego w kierunku tectum.
6. Za pomocą nożyczek przetnij i usuń nerwy wzrokowe, a następnie usuń obie strony najbardziej bocznej części czaszki na poziomie tectum. Obróć głowę brzuszną stroną do góry. Za pomocą kleszczy oderwij resztę najbardziej wierzchołkowej części czaszki.
7. Przenieś mózg wraz z pozostałą częścią czaszki do nowego naczynia z pożywką separacyjną (DMEM/F12 z penicyliną/streptomycyną). Oczyść tkankę mózgową w podłożu preparacyjnym za pomocą plastikowego uchwytu mikronoża, zachowując wszystkie struktury mózgu w stanie nienaruszonym.
8. Od tego momentu kontynuuj protokół, używając całego mózgu danio pręgowanego.
   1. Alternatywnie dostosuj ten protokół do określonych regionów mózgu, aby wygenerować neurosfery z całego mózgu danio pręgowanego lub z kresomózgowia, tectum/międzymózgowia lub móżdżku wyciętego świeżym skalpelem. Użyj neuronalnej specyficznej dla fluorescencyjnej neuronalnej linii transgenicznej danio pręgowanego, aby przeanalizować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania zgodnie z ryciną 1.

Wyniki

Rycina 1: Różnicowanie neurosfer pochodzących z mózgu danio pręgowanego.(A-C, E) Obrazy z kontrastem fazowym całych neurosfer pochodzących z mózgu hodowanych w pożywce różnicowania Z przez 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) i 4 (C i D, DiVd4) dni. (E) Widok grzbietowy całego mózgu 12-miesięczne...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/F12 1x	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11330-032
Penicylina-streptomycyna	Technologie życiowe	Rozdział 15140-122
Trikaina MS-222	Sigma	Ciągnik hamulcowy A5040	roztwór podstawowy 4 mg/ml