Wstrzyknięcie ortotopowe: wszczepianie komórek rakowych specyficznych tkankowo dorosłej myszy

Streszczenie

Źródło: Katsuta, E., et al. Generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy.J. Vis. Exp.(2018).

Film demonstruje technikę ortotopowej inokulacji raka piersi na modelu mysim. Technika ta zapewnia wysoki wskaźnik nowotworzenia przy mniejszej zmienności wielkości i kształtu guza w porównaniu z wstrzyknięciem podskórnym lub niechirurgicznym.

Protokół

1. Przygotowanie komórek (dla 10 myszy)

UWAGA: Komórki powinny być zaszczepione w ciągu 1 godziny po odłączeniu od naczynia, aby uniknąć spadku żywotności komórek. W szczególności zawiesinę komórkową należy wymieszać z galaretowatą mieszaniną białek w ciągu 15 minut po odłączeniu komórek od naczynia, aby zachować ich żywotność.

1. Hodowla komórek 4T1-luc2, linii komórkowej gruczolakoraka sutka myszy wykazującej ekspresję lucyferazy, w pożywce RPMI 1640 z 10% FBS w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
2. Przemyć przylegające komórki 4T1-luc2 w 10-centymetrowym naczyniu z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny za pomocą pipety P1000, a następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Następnie dodać 4 ml pożywki wzrostowej (RPMI-1640 z 10% FBS) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w kapturze do hodowli tkankowej. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 180 x g przez 5 minut.
3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml PBS, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
4. Zawiesić 2 x 10⁶ komórek 4T1-luc2 w 40 μl zimnego PBS (pH 7,4, 4 °C) w kapturze do hodowli tkankowej.
5. Wymieszać 40 μl zawiesiny komórek z 360 μl galaretowatej mieszaniny białek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie w kapturze do hodowli tkankowych.
   UWAGA: Końcowe stężenie wynosi 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS: galaretowata mieszanina białek). W przypadku modelu ortotopowego (bez mastektomii) użyto 1 x 10⁴/20 μL końcowego stężenia, aby uniknąć osiągnięcia kryteriów eutanazji (wielkość guza > 2 cm) w ciągu dwóch tygodni.

2. Inokulacja komórek rakowych

1. Umieść myszy w komorze indukcyjnej znieczulenia z 2-4% izofluranem i przepływem tlenu 0,2 l/min, aż myszy będą spokojnie oddychać (2-3 min).
2. Chwycić mysz i wstrzyknąć podskórnie 0,05 mg/kg buprenorfiny w jej ramię.
3. Potwierdź odpowiednie znieczulenie poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Włóż nos myszy do otworu maski myszy, która umożliwia znieczulenie wziewne z 2-4% izofluranem i przepływem tlenu 2 l/min podłączonym do kanistra z węglem drzewnym.
4. Unieruchomij kończyny myszy za pomocą taśmy laboratoryjnej i wysterylizuj jej skórę za pomocą chlorheksydyny, jodu i 75% etanolu, używając bawełnianych wacików.
5. Wykonaj 5-milimetrowe nacięcie skóry na środku przedniej ściany klatki piersiowej za pomocą sterylnych nożyczek do mikrodysekcji, podnieś skórę po prawej stronie obok nacięcia i odłącz skórę od ściany klatki piersiowej za pomocą nożyczek, a następnie odwróć skórę, aby odsłonić prawą poduszkę tłuszczową sutka #2.
6. Ostrożnie wstrzyknąć 20 μl zawiesiny komórek rakowych za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 28,5 G do poduszeczki tłuszczowej w bezpośrednim polu widzenia przez ranę.
   UWAGA: Igła przechodzi przez ranę, a nie przez skórę. Trzymaj igłę w poduszce tłuszczowej przez 5 sekund przed jej wyciągnięciem, co daje czas na zestalenie się galaretowatej mieszanki białek.
7. Zamknij nacięcia skóry poprzez zszycie, używając sterylnych niewchłanialnych szwów 5-0.
8. Po operacji należy umieścić zwierzęta z powrotem w czystej klatce i monitorować je do czasu, aż wyzdrowieją i będą się swobodnie poruszać (po ~1-2 minutach). Jeśli zwierzę nie wydaje się być w dobrym stanie zdrowia w ciągu 24 godzin od zabiegu, należy podać buprenorfinę (0,2 mg/kg).
9. Usunąć szwy w znieczuleniu (patrz krok 2.1) 7 dni po zabiegu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nożyczki do mikro rozwarstwiania	Roboz powiedział:	Złącze RS-5983	Do innokulacji komórek rakowych i mastektomii
5-0 Szwy jedwabne	patrzeć	774B F
Instytut Pamięci w Roswell Park w 1640	Gibco (firma Gibco)	11875093	Do hodowli komórkowej
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	10437028	Do hodowli komórkowej
Trypsyna-EDTA (0,25%)	Gibco (firma Gibco)	25200056	Do hodowli komórkowej
Suchy środek sterylizujący (Germinator 500)	Naukowe drzewo mózgów	GER 5287-120V	Do innokulacji komórek rakowych i mastektomii
Uchwyt igły	Roboz powiedział:	Złącze RS-7830	Do innokulacji komórek rakowych i mastektomii
Kleszcze Adson	Roboz powiedział:	Złącze RS-5233	Do innokulacji komórek rakowych i mastektomii
kliper	Wahl	9908-717	Do innokulacji komórek rakowych i mastektomii
Matrigel	Corning	354234	Do inokulacji komórek rakowych

r.