Ortotopowe przeszczepianie kończyny tylnej u szczurów

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy procedurę ortotopowego przeszczepienia kończyny tylnej szczura, która wydaje się być złotym standardem modelu in vivo w badaniach nad allotransplantacją tkanek złożonych.

Streszczenie

Allotransplantacja złożonych tkanek (CTA) stanowi obecnie właściwą opcję terapeutyczną po utracie dłoni, przedramienia lub palców i stała się nową jednostką terapeutyczną w chirurgii rekonstrukcyjnej. Jednakże, aby zapewnić przeżycie przeszczepu, wymagana jest długotrwała, wysokodawkowa, wielolekowa terapia immunosupresyjna, która niesie ze sobą ryzyko poważnych skutków ubocznych, co ogranicza szersze zastosowanie tej metody. Dalszy postęp w tej dziedzinie może zależeć od lepszego zrozumienia podstaw immunologii oraz uszkodzeń reperfuzyjnych po niedokrwieniu w przeszczepach złożonych tkanek.

Do tej pory ortotopowa transplantacja kończyny tylnej u szczurów była preferowanym modelem gryzoni w badaniach nad transplantacją rekonstrukcyjną (RT), jednak jest to procedura niezwykle wymagająca, która wiąże się z koniecznością posiadania nadzwyczajnych umiejętności mikrochirurgicznych w celu ponownego połączenia naczyń krwionośnych, kości, mięśni i nerwów.

Wprowadziliśmy technikę anastomozy z wykorzystaniem mankietu naczyniowego do tego modelu, zapewniając szybkie i niezawodne podejście do transplantacji kończyny tylnej szczura. Technika ta upraszcza i skraca procedurę chirurgiczną oraz umożliwia chirurgom z podstawowym doświadczeniem w mikrochirurgii pomyślne przeprowadzenie operacji przy wysokim wskaźniku przeżywalności i niskiej częstości występowania powikłań. Technika ta wydaje się być odpowiednia zarówno do badań immunologicznych, jak i badań nad uszkodzeniem reperfuzyjnym (IRI).

Protokół

Operacja dawcy i pobranie kończyny tylnej

1. Do procedury operacyjnej wykorzystuje się sterylny zestaw narzędzi mikrochirurgicznych. Chirurg powinien mieć na sobie odpowiednią odzież, w tym sterylne rękawiczki, które należy zmienić przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego.
2. Szczura poddaje się znieczuleniu poprzez domięśniowy zastrzyk pentobarbitalu (50mg/kg IP) i umieszcza w pozycji grzbietowej na podgrzewanym polu operacyjnym, co zapewnia stabilną temperaturę ciała zwierzęcia przez cały czas trwania zabiegu.
3. Przed nacięciem skóry pole operacyjne odkaża się trzykrotnie, stosując zarówno środek dezynfekcyjny, jak i alkohol. Aby zapobiec wysychaniu rogówek zwierzęcia, przed operacją oczy smaruje się maścią okulistyczną (Vidisic).
4. Wykonuje się nacięcie skóry w obrębie prawej pachwiny, mniej więcej na poziomie więzadła pachwinowego. Naczynia udowe zostają wypreparowane za pomocą kauteryzacji bipolarnej i rozcięcia tępym narzędziem; głębokie gałęzie podwiązuje się nicią jedwabną 8-0.
5. W celu przeciwzakrzepowego działania przez żyłę prątną wstrzykuje się 300μl (50 IU) heparyny.
6. Naczynia udowe podwiązuje się na poziomie więzadła pachwinowego i przecina dystalnie względem podwiązania.
7. Kończynę tylną płucze się lodowatym (4°C) roztworem HTK (5ml) poprzez tętnicę udową w ciągu 5 minut.
8. Wszystkie grupy mięśniowe rozcina się ostro nożyczkami i wykonuje osteotomię za pomocą obrotowej piły elektrycznej na poziomie dystalnej części uda.
9. Pobraną kończynę zanurza się następnie w 20mL lodowatego roztworu HTK w celu konserwacji i przechowywania w niskiej temperaturze do czasu transplantacji.

Operacja i transplantacja biorcy

1. Szczur zostaje poddany znieczuleniu poprzez doszpikowe wstrzyknięcie pentobarbitalu i ułożony na plecach w polu operacyjnym.
2. Wykonuje się nacięcie skóry w obrębie prawej pachwiny, mniej więcej na poziomie więzadła pachwinowego. Naczynia udowe zostają wypreparowane za pomocą kauteryzacji bipolarnej i tępej dyssekcji.
3. Naczynia udowe zostają podwiązane tak dystalnie, jak to możliwe, lecz proksymalnie w stosunku do odejścia naczyń nadłonowych. Zaciski naczyniowe zostają umieszczone na poziomie więzadła pachwinowego na tętnicy i żyle.
4. Polietylenową mankietkę nasuwa się na tętnicę (średnica wewnętrzna mankietki: 0,912 mm, grubość ścianki mankietki: 0,010 mm, długość mankietki: 2,0 mm) oraz żyłę (średnica wewnętrzna mankietki: 1,151 mm, grubość ścianki mankietki: 0,010 mm, długość mankietki: 2,0 mm). Następnie krawędź światła naczynia zostaje wyciągnięta za pomocą rozszerzacza naczyniowego, a tętnica i żyła udowa zostają wywinięte na całej długości mankietki (około 2 mm) i utrwalone okrężną ligaturą jedwabną 8-0.
5. Aby zrobić miejsce dla kończyny dawcy, kończynę biorcy usuwa się poprzez ostrą dyssekcję grup mięśniowych, a osteotomię wykonuje się w połowie kości udowej.
6. Kończynę dawcy wyjmuje się z roztworu HTK, a transplantację rozpoczyna się od osteosyntezy kości udowej, używając igły 18G (długość: 1,5-2,0 cm) jako gwoździa śródszpikowego.
7. Brzuszne grupy mięśniowe zostają ściśle zbliżone za pomocą przerwanych szwów z nici Vicryl lub Prolene 4-0.
8. Anastomozy naczyniowe wykonuje się poprzez nasunięcie żyły i tętnicy dawcy na kompleks żyły i mankietki biorcy. Ponownie wykonuje się okrężną ligaturę jedwabną 8-0 w celu zabezpieczenia anastomozy.
9. Zdejmuje się zacisk żylny, a następnie tętniczy; reperfuzję stwierdza się poprzez powrót kolorytu dystalnej części kończyny i stopy, a także tętniący przepływ w tętnicy.
10. Pozostałe grzbietowe grupy mięśniowe zostają ponownie zbliżone za pomocą przerwanych szwów z nici Vicryl lub Prolene 4-0.
11. Skórę zamyka się przerwanymi szwami z nici Vicryl lub Prolene 4-0.
12. Szczura biorcę umieszcza się na podgrzewaczce i monitoruje ściśle aż do wybudzenia.
13. Zwierzęta biorcze otrzymują profilaktycznie antybiotyki (Cefazolina, 20 mg/dobę, IM) oraz Buprenex (0,1 mg/kg, SC) przez trzy dni po transplantacji.

Dyskusja

Dziesięciolecia badań eksperymentalnych poprzedzały i umożliwiły pomyślne przeszczepy dłoni u ludzi w niedawnym czasie. W 1978 roku Shapiro i współpracownicy opracowali model ortotopowego przeszczepu kończyny tylnej u szczurów, który dobrze nadaje się do badania różnych aspektów patologicznych, fizjologicznych i immunologicznych, a także efektów funkcjonalnych przeszczepów złożonych tkanek. Zmodyfikowaliśmy najtrudniejszą część procedury, mianowicie anastomozę naczyniową, wprowadzając technikę mankietową bezszwowa. W por...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nembutal®	OVATION Pharmaceuticals
Heparyna Immuno	Ebewe Pharma
Roztwór Custodiol HTK	Essential Pharmaceuticals
Nożyczki do osłonki	ASSI	ASSI®SAS-21 R-8T
Kleszczyki	ASSI	ASSI®JFC-7
Kleszczyki rozszerzające	ASSI	ASSI®D-5AZ
Rurki polimidowe	River Tech Medical	#17; #19