$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Decellularyzacja
UWAGA: Ta procedura została zaadaptowana z wcześniej opublikowanych metod skoncentrowanych na decelularyzacji tkanki tłuszczowej, które obejmowały detergent jonowy deoksycholanu sodu, a nie dodecylosiarczan sodu, aby skutecznie usunąć DNA.
- W dniu 1 wyjmij zamrożone poduszeczki tłuszczowe lub urządzenia wielofunkcyjne z temperatury -80 °C i rozmroź w temperaturze pokojowej.
- Po rozmrożeniu wysusz urządzenia wielofunkcyjne na krótko na delikatnej ściereczce. Zważ urządzenia wielofunkcyjne za pomocą wagi analitycznej.
- Za pomocą kleszczy z nożyczkami lub skalpelem podziel tkankę na próbki o wymiarach 3 mm x 3 mm x 3 mm w celu zbadania nienaruszonego ECM i pozostałej tkanki do produkcji hydrożelu.
nuta: Liczba próbek zależy od liczby metod badawczych, np. pobranie dwóch próbek opisano poniżej: jedną do zatapiania parafiny (etap 1.5) i jedną do zamrażania w podłożu do zatapiania kriostatu, jeśli jest to pożądane (patrz tabela materiałów i krok 1.6).
- Zważ tkanki. W przypadku zatapiania w parafinie w celu przekroju, przejdź do kroku 1.5. W przypadku zamrażania w podłożu do zatapiania kriostatu w celu podziału, przejdź do kroku 1.6.
- W kapturze chemicznym zanurzyć tkankę w 10% obojętnej buforowanej formalinie (NBF) (patrz Tabela Materiałów) na 24 godziny w temperaturze 4 °C. Umyć 3 razy w PBS przez 5 minut każdy. Zanurzyć tkankę w 30% sacharozie na 48 godzin w temperaturze 4 °C.
- Zważ tkankę teraz, gdy ten kawałek został usunięty. Przejdź do kroku 1.6.
- W okapie chemicznym umieść elementy MFP w oznakowanej kasecie przygotowanej z podłożem do zatapiania kriostatu. Dodaj więcej podłoża do zatapiania kriostatu, aby pokryć tkankę.
- Umieść kasetę w zlewce z 2-metylobutanem (patrz tabela materiałów), która jest wstępnie schłodzona ciekłym azotem. Zlewka powinna mieć wystarczającą ilość 2-metylobutanu, aby pokryć dno, ale nie wystarczająco, aby zanurzyć kasetę, ponieważ podłoże do zatapiania kriostatu nie powinno dotykać 2-metylobutanu. Pozostaw kasetę w 2-metylobutanie, aż podłoże zatapiające kriostat zamarznie i stanie się nieprzezroczyste.
- Zawiń kasetę (kasety) w folię, etykietę i pozostaw w temperaturze -80 °C do momentu użycia do podziału.
nuta: Tkanki umieszczone bezpośrednio w pożywce do zatapiania kriostatu podzielono na sekcje z prędkością 5 μm, natomiast tkanki inkubowane w sacharozie podzielono na sekcje z prędkością 30 μm, aby zachować morfologię adipocytów.
- Użyj kleszczy, aby ręcznie masować pozostałą tkankę.
nuta: Fragmenty tkanek można również umieścić w 10% NBF na 24–48 godzin, przepłukać w PBS i pozostawić w 70% etanolu do momentu zatopienia w parafinie. Po zatopieniu, skrawki 5 μm można wykorzystać do barwienia hematoksyliną i eozyną (H i E) (patrz sekcja 2 poniżej).
- Umieść urządzenia wielofunkcyjne w 6-centymetrowych naczyniach z 5 ml 0,02% roztworu trypsyny/0,05% EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Spryskaj i przetrzyj naczynia 70% etanolem przed umieszczeniem w inkubatorze.
- Użyj sitek o średnicy 0,7 mm, aby umyć urządzenia wielofunkcyjne wodą dejonizowaną (DI), trzykrotnie zalewając chusteczkę wodą. Użyj kleszczy, aby ręcznie masować tkankę między myciami.
- Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Umieść chusteczki w wstępnie autoklawizowanej zlewce zawierającej mieszadło o odpowiedniej wielkości. Przykryj tkanki 60 ml 3% t-oktylofenoksypolietylenu (patrz Tabela Materiałów) na 1 g tkanki i mieszaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Użyj co najmniej 20 ml.
- Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka. Opłucz zlewkę wodą demineralizowaną i wylej na chusteczki. Powtórz jeszcze dwa razy. Użyj kleszczy, aby ręcznie masować tkankę między płukaniami.
- Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Umieść chusteczki i kostki mieszadła z powrotem w tych samych zlewkach i przykryj 60 ml 4% kwasu dezoksycholowego na 1 g tkanki. Mieszaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Użyj co najmniej 20 ml.
- Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka siatkowego. Opłucz zlewkę wodą demineralizowaną i wylej na chusteczki. Powtórz jeszcze dwa razy. Użyj kleszczy, aby ręcznie masować tkankę między płukaniami.
- Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ.
- Umieść tkanki w tej samej zlewce ze świeżą wodą demineralizowaną uzupełnioną 1% penicyliną-streptomycyną. Przykryj szczelnie folią parafinową. Pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
- Umyj sitka i zlewki do użycia następnego dnia.
- W 2. dniu odcedź zawartość zlewki na sitko. Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ.
- Umieść urządzenia wielofunkcyjne w tej samej zlewce z mieszadłem o odpowiedniej wielkości. Przykryj 60 ml 4% roztworu etanolu/0,1% kwasu nadoctowego na 1 g tkanki. Użyj co najmniej 20 ml. Mieszaj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka o średnicy 0,7 mm. Użyj kleszczy do ręcznego masażu tkanki. Umieść zawartość z powrotem w zlewce. Umyj chusteczkę, przykrywając ją 60 ml 1x PBS na 1 g chusteczki. Użyj co najmniej 20 ml. Mieszaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz raz.
- Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka o średnicy 0,7 mm. Użyj kleszczy do ręcznego masażu tkanki. Umieść zawartość z powrotem w zlewce. Umyj chusteczkę, zalewając ją 60 ml wody DI na 1 g chusteczki. Użyj co najmniej 20 ml. Mieszaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz raz.
- Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka. Użyj kleszczy do ręcznego masażu tkanki.
- Umieść zawartość z powrotem w zlewce. Przykryj tkanki 60 ml 100% n-propanolu na 1 g tkanki. Użyj co najmniej 20 ml. Mieszaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka o średnicy 0,7 mm. Użyj kleszczy do ręcznego masażu tkanki.
- Umieść zawartość z powrotem w zlewce. Umyj chusteczkę, przykrywając ją 60 ml wody demineralizowanej na 1 g chusteczki. Użyj co najmniej 20 ml. Mieszaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz trzy razy.
- Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka. Powtórz kroki 2.3–2.6, aby zebrać kawałki tkanki do inkubacji i zamrażania sacharozy w pożywce do zatapiania kriostatu.
- Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Umieść w oznaczonej probówce o pojemności 15 ml. Zamrażać w temperaturze -80 °C przez noc.