$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ustanowienie trzech niezależnych linii komórkowych PC-9 odpornych na afatynib
- Oznaczanie początkowego stężenia ekspozycji na afatynib dla komórek PC-9 przy użyciu testu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT).
- Hodowla komórek PC-9 w pożywce wzrostowej zawierającej płodową surowicę bydlęcą (10%), penicylinę (100 U/ml) i streptomycynę (100 μg/ml) w 10-centymetrowym naczyniu poddanym działaniu hodowli komórkowej w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Ponownie zawiesić komórki PC-9 przy 4 x 104 komórkach / ml w pożywce wzrostowej, a następnie wysiewać w 50 μl / dołku na 96-dołkowej mikropłytce. Końcowe stężenie komórek wynosi 2,0 x 103 komórki/50 μL/studzienkę. Inkubować przez noc w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37°C.
- Dodać 50 μl roztworu afatynibu o różnych stężeniach: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 i 20 μM do studzienek zawierających pożywkę wzrostową (50 μL). Końcowa objętość i stężenia afatynibu wynoszą odpowiednio 100 μl i 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 i 10 μM.
- Inkubować 96-dołkową płytkę przez 96 godzin w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Dodać 15 μl roztworu barwnika (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki i inkubować przez 4 godziny w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C, a następnie dodać 100 μl roztworu solubilizacyjnego/zatrzymującego (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki i inkubować przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Zmierzyć gęstość optyczną przy 570 nm (OD570) za pomocą czytnika mikropłytek (patrz Tabela materiałów). Przygotować 6-12 powtórzeń i powtórzyć eksperymenty co najmniej trzy razy.
- Użyj oprogramowania statystycznego (patrz Spis materiałów), aby graficznie wykreślić te dane jako wykres półlogarytmiczny i obliczyć wartość IC50, czyli stężenie leku, które zmniejsza odpowiedź do 50% jej maksimum (patrz Tabela materiałów).
- Ciągła ekspozycja komórek PC-9 na nieodwracalny EGFR-TKI, afatynib, poprzez stopniowe zwiększanie dawki w trzech niezależnych 10-centymetrowych szalkach
- Hodowla komórek PC-9 na szalkach p100 zawierających 10 ml pożywki wzrostowej. Gdy komórki PC-9 osiągną etap sub-konfluencji, przenieś 1 ml zawiesiny komórkowej do trzech nowych szalek p100 z 9 ml pożywki wzrostowej. Rozcieńczone w stosunku 1:10 komórki PC-9 stają się subkonfluentne w ciągu 3-4 dni, z liczbą komórek około 4-5 x 105 komórek / ml.
- Następnego dnia dodaj 1/10 wartości IC50 afatynibu do każdej z trzech szalek p100.
UWAGA: Afatynib rozpuszcza się w DMSO w stężeniach podstawowych 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM i 5 mM. 1 do 10 μl roztworu afatynibu dodaje się do 10 ml pożywki wzrostowej w hodowli, zgodnie z wymaganymi stężeniami końcowymi.
- Gdy komórki w szalkach p100 zawierających afatynib ulegną subkonfluencji, dobrze wymieszaj przez aspirację pipetą o pojemności 1 ml i dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do 9 ml świeżej pożywki wzrostowej w nowym naczyniu p100. Następnie dodaj o 10-20% wyższe stężenie afatynibu do nowej hodowli.
- Zwiększyć stężenie afatynibu z 0,1 nM do 1 μM w pożywce poprzez stopniowe zwiększanie dawki przy jednoczesnym zwiększaniu stężenia afatynibu o 10-20% na każdym etapie przez okres 10-12 miesięcy.
nuta: Gdy stężenie afatynibu zbliża się do wartości IC50, wzrost komórek staje się dość powolny. Jeśli komórki zostaną podzielone w stosunku 1:9, mogą nie rosnąć, ponieważ komórki te są zabijane przez wyższe stężenia afatynibu. Dlatego przy wyższych stężeniach afanitybu komórki można podzielić w stosunku 1:2. Najbardziej oporne komórki hodowano w pożywce zawierającej afatynib przez 3-14 dni, a pożywka nie była zmieniana, dopóki oporne komórki nie musiały zostać przeniesione.
- Hodować komórki oporne na afatynib przez 2-3 miesiące w pożywce wzrostowej zawierającej 1 μM afatynib. Przy stężeniu afatynibu wynoszącym 1 μM do rozwinięcia oporności na afatynib w tym modelu potrzeba 10-12 miesięcy. Wykonaj test MTT, aby potwierdzić, że komórki są oporne na afatynib. Trzy niezależnie ustalone linie komórkowe oporności na afatynib zostały nazwane AFR1, AFR2 i AFR3.