$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie próbek tkanki nowotworowej
- Utrwal tkankę nowotworową w 10% neutralnej buforowanej formalinie (NBF) w kasecie.
nuta: Tkanka nowotworowa z proksymalnych guzów płuc jest zwykle uzyskiwana za pomocą bronchoskopii, wykonywanej w umiarkowanej sedacji przez pulmonologa lub specjalistę od płuc. W przypadku zmian obwodowych i rozlanej choroby płuc wskazana jest biopsja przezoskrzelowa lub igłowa. Zabiegi te są zwykle wykonywane na sali operacyjnej lub oddziale intensywnej terapii.
- Zanurz kasetę w parafinie.
nuta: Utrwalenie można osiągnąć przez perfuzję lub zanurzenie bezpośrednio po rozwarstwieniu i zwykle wymaga 8–10 godzin. Objętość utrwalacza powinna być 15–20 razy większa niż objętość próbki. Nie zaleca się utrwalania tkanki biopsyjnej dłużej niż 10 godzin, ponieważ nadmierne utrwalenie może spowodować maskowanie antygenu. Prędkość utrwalania wynosi około 1 mm/h w temperaturze pokojowej.
- Naciekać utrwaloną próbkę tkanki woskiem w procesorze tkanek (patrz Tabela materiałów).
nuta: Odwodnienie przeprowadza się w trzech kąpielach alkoholowych o rosnących stężeniach 70%, 85% i 90%. Woda jest ostatecznie usuwana przez trzy ostatnie absolutne kąpiele alkoholowe. Oczyszczanie odbywa się w trzech kąpielach toluenowych, a infiltracja wosku w gorących kąpielach woskowych (44–60 °C).
- Zanurz tkankę w formie wypełnionej stopioną parafiną (patrz Tabela materiałów) i poczekaj na zestalenie.
- Tkankę zatopioną w parafinie należy przeciąć na mikrotomie o grubości 3 μm.
- Przenieś wstęgę parafinową na dodatnio naładowane szkiełko mikroskopowe (patrz Tabela materiałów).
- Suszyć szkiełko przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
Uwaga: Skrawki tkanki należy przechowywać w temperaturze 2–8 °C (preferowane) lub w temperaturze pokojowej do 25 °C, aby zachować antygenowość, i zabarwić w ciągu 15 dni od cięcia.
2. Przygotowanie próbek cytologicznych
- Zebrać popłuczki z oskrzeli w roztworze konserwującym (patrz Tabela materiałów).
nuta: W tym celu stosuje się standardową technikę bronchoskopii.
- Płukanie rozkładu oskrzeli, z którego ma zostać pobrane próbki. Zbierz pranie do czystego pojemnika. Oznacz pojemnik imieniem i nazwiskiem pacjenta, datą urodzenia i źródłem próbki.
- Przenieść popłuczyny oskrzelowe do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać 2 g proszku DL-ditiotreitolu (patrz tabela materiałów), wirować probówkę przez 30 minut, a następnie odwirować ją przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant i dodać 10 ml roztworu mukolitycznego (patrz tabela materiałów).
- Potrząsać próbką przez 20 minut ze średnią prędkością (poziom 9) i odwirowywać ją przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant i umieścić osad komórkowy w probówkach zbiorczych zawierających 10% NBF.
- Dodać 4 krople odczynnika do przygotowania bloku komórkowego (patrz Tabela materiałów) do osadu komórkowego.
- Przenieś osad komórkowy do kasety, utrwal go w 10% NBF i zatapiaj w parafinie w celu przygotowania i podziału bloku komórkowego (patrz kroki 1.1–1.7).