Test tworzenia kolonii: ocena skuteczności środków przeciwnowotworowych na komórkach raka płuc tworzących kolonie

Streszczenie

Źródło: Lee, J. Y.et al, Przedkliniczna ocena bioaktywności przeciwnowotworowej kumaryny OT48 za pomocą sferoidów, testów tworzenia kolonii i ksenoprzeszczepów danio pręgowanego.J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje test tworzenia kolonii, który pomaga określić zdolność komórek raka płuc do rozmnażania się w nieskończoność i tworzenia indywidualnych kolonii. Możemy przeanalizować wpływ środka przeciwnowotworowego na komórki tworzące kolonie, analizując zmiany w liczbie i/lub wielkości powstałych kolonii.

Protokół

1. Testy tworzenia kolonii

1. Hodowla komórek A549 w stężeniu 20 000 komórek/^cm2 w 15 ml pożywki do hodowli komórkowych RPMI1640 uzupełnionej 10% FBS (płodową surowicą bydlęcą) i 1% antybiotykami w kolbie o długości 75^cm2 w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. W dniu eksperymentu określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Zbierz 50 000 komórek przez odwirowanie przy 400 x g przez 7 minut w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i ponownie zawieś komórki w 100 μl 1x sterylnego PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) w probówkach o pojemności 1,5 ml.
3. Dozować 1,1 ml półstałego podłoża na bazie metylocelulozy (MCBM) do probówek o pojemności 15 ml za pomocą multipipety. Przygotuj jedną tubkę na każdy warunek.
4. Dodaj 110 μl FBS do 1,1 ml MCBM za pomocą mikropipety P200.
5. Komórki nasienne w ilości 1,000 komórek/ml. Zebrać 2,4 μl zawiesiny komórek z roztworu podstawowego (50 000 komórek w 100 μl 1x PBS) za pomocą mikropipety P2 i dodać do 1,1 ml MCBM uzupełnionego 10% FBS.
6. Po dodaniu komórek wiruj probówki przez 1 minutę, trzymając je pionowo z najwyższą prędkością, aby dobrze wymieszać MCBM i komórki.
7. Dodać badane związki (OT48 samodzielnie lub w połączeniu z A1210477). Przygotować oddzielną probówkę jako kontrolę dla użytego rozpuszczalnika (tutaj dimetylosulfotlenek (DMSO)). W zależności od stężenia związków i objętości dodanej dla każdego warunku, kontrola rozpuszczalnika będzie obejmować najwyższe stężenie rozpuszczalnika użyte do rozcieńczenia badanego związku, w celu oceny niekorzystnych skutków spowodowanych przez rozpuszczalnik.
8. Wiruj rurki przez 1 minutę.
9. Do każdego testu dodać 1 ml mieszaniny za pomocą mikropipety P1000 do środkowej studzienki 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
10. Napełnij puste studzienki 1 ml sterylnej wody lub 1x PBS, aby ustabilizować wilgotność.
11. Inkubować płytki hodowlane przez 10 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂
12. Po 10 dniach inkubacji dodać 200 μl roztworu podstawowego bromku MTT (metylotiazolyldiphenyl-tetrazolium) (5 mg/ml) do każdego dołka, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 mg/ml.
13. Inkubować przez 10 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Żywotne kolonie zmienią kolor na fioletowy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ciągnik siodłowy A549	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał CCL-185	37 stopni Celsjusza
Silnik RPMI 1640	Lonza	Numer katalogowy: 30096	4 ° C
FBS (Sieć Usługowa	Biowest (Zachód Biologi	S1520-500	-20 stopni Celsjusza
Penicylina-Streptomycyna	Lonza	17-602E	-20 stopni Celsjusza
Kolba do hodowli komórkowych T75	Spl	Numer katalogowy 70075	Rt
Rozwiązanie PBS	Klon	SH30256.02	Rt
Tubka 1,5 ml	Ekstragen	Rurka-170-C	Rt
Tubka 15 ml	Hyundai Micro	Rok H20015	Rt
Płytka 12-dołkowa	Spl	Numer katalogowy: 30012	Rt
Kult Metho	Technologie StemCell	Numer katalogowy: 4230	-20 stopni Celsjusza
Bromek tetrazolowy błękitu tiazolilowego (proszek MTT)	Sigma	Zobacz materiał M5622	4 ° C
LAS4000	GE Technologie dla służby zdrowia		Rt