1. Synteza kwasu hialuronowego-ceramidu (HACE)
- Rozpuścić 12,21 mmol oligomeru kwasu hialuronowego (HA) i 9,77 mmol wodorotlenku tetra-n-butyloamonu (TBA) w 60 ml podwójnie destylowanej wody (DDW). Mieszaj przez 30 minut.
- Aby zsyntetyzować łącznik DS-Y30, rozpuść 8,59 mmol ceramidu DS-Y30 i 9,45 mmol trietyloaminy w 25 ml tetrahydrofuranu (THF). Wymieszać z 8,59 mmol chlorku 4-chlorometylobenzoilu w THF. Mieszać przez 6 godzin w temperaturze 60 °C.
- Rozpuścić zsyntetyzowane 8,10 mmol HA-TBA i 0,41 mmol łącznika DS-Y30 w mieszaninie THF i acetonitrylu (4:1, v/v). Mieszać przez 5 godzin w temperaturze 40 °C.
- Usuń zanieczyszczenia przez filtrowanie za pomocą środka filtrującego i wyeliminuj rozpuszczalnik organiczny przez odparowanie próżniowe. Oczyścić produkt za pomocą membrany dializacyjnej (odcięcie masy cząsteczkowej: 3,5 kDa) i poddać liofilizacji.
2. Przygotowanie nanocząstek
- Rozpuścić 1 mg HB i 1 mg paklitakselu w 0,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i zmieszać z 0,5 ml DDW przez mieszanie wirowe przez 5 minut. Następnie rozpuścić HACE w tej mieszaninie przez mieszanie wirowe przez kolejne 5 minut.
- W celu wyeliminowania rozpuszczalnika należy ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 4 godziny pod delikatnym strumieniem azotu.
- Zawiesić błonę złożoną z HACE, HB i paklitakselu w 1 ml DDW. Przefiltrować z filtrem strzykawkowym (wielkość porów 0,45 μm) w celu usunięcia niekapsułkowanych leków.
3. Fototoksyczność in vitro
- Wychwyt nanocząstek w liniach komórkowych raka płuc
- Przygotować RPMI-1640 zawierające 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej i 1% (w/v) penicyliny-streptomycyny.
- Nasiona komórek A549 na 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych o gęstości 1 × 105 komórek/basenik (trzykrotnie dla każdej grupy). Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 5%CO2 i 95% powietrza.
- Po przyłączeniu komórek usuń pożywkę i umyj komórki, dodając 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Rozpuścić nanocząstki w PBS do końcowego stężenia 2 μM/ml HB. Następnie inkubować komórki z 1 ml PBS, pustymi NPs, HB-NP lub HB-P-NPs w każdym dołku przez 4 godziny w ciemności.
- Usuń cały roztwór i przemyj komórki, dodając 1 ml zimnego PBS. Powtórz krok prania jeszcze raz. Dodaj świeżą pożywkę hodowlaną.
- Test żywotności komórek
- Umieść płytkę do hodowli komórkowej pod włóknem PDT (z zachowaniem 1 cm odległości od włókna PDT do studzienki). Nosić laserowe okulary ochronne i oświetlać komórki laserem PDT (630 nm, 400 mW/cm2) w ciemności przez różne okresy czasu: 0, 5, 10, 20, 30 i 40 sekund (0, 2, 4, 8, 12 i 16 J/cm2). Następnie inkubuj komórki przez 24 godziny w ciemności.
- Odessać pożywkę i przemyć komórki, dodając 1 ml zimnego PBS. Powtórz krok prania jeszcze raz.
- Do każdego dołka dodać 10 μl roztworu do pomiaru cytotoksyczności. Inkubować w ciemności przez 2 godziny.
- Zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
