$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Synteza kwasu hialuronowego-ceramidu (HACE)
- Rozpuścić 12,21 mmol oligomeru kwasu hialuronowego (HA) i 9,77 mmol wodorotlenku tetra-n-butyloamonu (TBA) w 60 ml podwójnie destylowanej wody (DDW). Mieszaj przez 30 minut.
- Aby zsyntetyzować łącznik DS-Y30, rozpuść 8,59 mmol ceramidu DS-Y30 i 9,45 mmol trietyloaminy w 25 ml tetrahydrofuranu (THF). Wymieszać z 8,59 mmol chlorku 4-chlorometylobenzoilu w THF. Mieszać przez 6 godzin w temperaturze 60 °C.
- Rozpuścić zsyntetyzowane 8,10 mmol HA-TBA i 0,41 mmol łącznika DS-Y30 w mieszaninie THF i acetonitrylu (4:1, v/v). Mieszać przez 5 godzin w temperaturze 40 °C.
- Usuń zanieczyszczenia przez filtrowanie za pomocą środka filtrującego i wyeliminuj rozpuszczalnik organiczny przez odparowanie próżniowe. Oczyścić produkt za pomocą membrany dializacyjnej (odcięcie masy cząsteczkowej: 3,5 kDa) i poddać liofilizacji.
2. Przygotowanie nanocząstek
- Rozpuścić 1 mg HB i 1 mg paklitakselu w 0,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i zmieszać z 0,5 ml DDW przez mieszanie wirowe przez 5 minut. Następnie rozpuścić HACE w tej mieszaninie przez mieszanie wirowe przez kolejne 5 minut.
- W celu wyeliminowania rozpuszczalnika należy ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 4 godziny pod delikatnym strumieniem azotu.
- Zawiesić błonę złożoną z HACE, HB i paklitakselu w 1 ml DDW. Przefiltrować z filtrem strzykawkowym (wielkość porów 0,45 μm) w celu usunięcia niekapsułkowanych leków.
3. Skuteczność przeciwnowotworowa in vivo u myszy z nowotworem
- Mysi model wywołany rakiem płuc
- Przygotuj 1 × 106 komórek A549 w 0,1 ml pożywki RPMI-1640; trzymaj ją w lodzie.
- Znieczulenie myszy za pomocą iniekcji dożylnej ksylazyny i mieszaniny tiletaminy i zolazepamu (1:2, 1 ml/kg). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, delikatnie szczypiąc mały fałd skóry myszy. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
nuta: Jeśli nie zaobserwuje się żadnego ruchu, zwierzę jest wystarczająco znieczulone, aby rozpocząć eksperymenty.
- Wstrzyknąć komórki podskórnie w lewe boki nagich samców myszy BALB/C (6-7 tygodni, 20-22 g).
- Obserwuj myszy, aż zaczną poruszać się po klatce.
nuta: Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje. Trzymaj myszy w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF).
- Codziennie mierz rozmiar guza za pomocą suwmiarki. Oblicz objętość guza (mm3) jako (długość × szerokość2) / 2. Gdy rozmiar guza osiągnie około 200 mm3 objętości, rozpocznij eksperyment.
- Badanie skuteczności przeciwnowotworowej
- Losowo podziel myszy na 4 grupy (n = 10 dla każdej grupy).
- Znieczulenie myszy za pomocą iniekcji dożylnej ksylazyny i mieszaniny tiletaminy i zolazepamu (1:2, 1 ml/kg). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, delikatnie szczypiąc mały fałd skóry myszy. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
nuta: Jeśli nie zaobserwuje się żadnego ruchu, zwierzę jest wystarczająco znieczulone, aby rozpocząć eksperymenty.
- Rozpuścić nanocząstki w PBS do końcowego stężenia 2 mg/ml HB. Wstrzyknąć PBS, wolne HB, HB-NPs lub HB-P-NPs przez żyłę ogonową (2 mg/kg w przeliczeniu na HB) dwa razy w dniach 0 i 7.
- Obserwuj myszy, aż zaczną poruszać się po klatce.
nuta: Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje. Utrzymuj klatki w ciemności i w określonych warunkach SPF.
- 24 godziny po każdym wstrzyknięciu należy znieczulić myszy zastrzykiem dożylnym ksylazyny oraz mieszaniny tiletaminy i zolazepamu (1:2, 1 ml/kg). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, delikatnie szczypiąc mały fałd skóry myszy. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
nuta: Jeśli nie zaobserwuje się żadnego ruchu, zwierzę jest wystarczająco znieczulone, aby rozpocząć eksperymenty.
- Umieść miejsce guza pod włóknem PDT (z zachowaniem 1 cm odległości od włókna PDT do guza). Załóż laserowe okulary ochronne, wyłącz przełącznik i oświetl guz laserem PDT (630 nm, 400 mW/cm2) przez 500 sekund (200 J/cm2) dwa razy w 1 i 8 dniu.
- Obserwuj myszy, aż zaczną poruszać się po klatce. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
- Utrzymuj klatki w warunkach SPF. Utrzymuj klatki w ciemności przez 24 godziny po zabiegu laserowym.
- Codziennie monitoruj wizualnie objętość guza i zmiany w miejscu guza. Zmierz rozmiar guza za pomocą suwmiarki i oblicz objętość jako (długość × szerokość2) / 2 (mm3). Codziennie rób zdjęcia miejsc guza, aby sprawdzić, czy nie ma zmian na powierzchni guza po PDT.
- W dniu 16 należy poskładać ofiarę pięciu myszy na grupę w znieczuleniu końcowym przy użyciu izofluranu.
- Za pomocą kleszczy i nożyczek przetnij zewnętrzną skórę i odsłoń guzy. Ostrożnie je zbierz. Utrwal je w 10% formalinie, zanurz w parafinie i wybarwij hematoksyliną i eozyną (H&E) do analizy histologicznej.
- Po 45 dniach monitorowania należy poświębić pozostałe myszy w znieczuleniu końcowym przy użyciu izofluranu.