Artykuł metodologiczny

Odpowiedź chemotaktyczna mikroorganizmów morskich na mikroskalowe warstwy składników odżywczych

DOI:

10.3791/203

⸱

28 maja 2007

 ,  , 
1Environmental Microfluidics Group, MIT - Massachusetts Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano proces wytwarzania kanałów mikroprzepływowych oraz ich zastosowanie w eksperymentach służących do badania zachowań chemotaktycznych morskich drobnoustrojów w niejednorodnym środowisku nutrientowym (patchy nutrient seascape) oraz zachowań pływackich bakterii w przepływie ścinającym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Stopień, w jakim mikroby planktonowe potrafią wykorzystywać mikroskalowe plamy zasobów, będzie miał znaczące implikacje dla trofodynamiki oceanicznej i strumieni biogeochemicznych. Jednak aby móc korzystać z plam nutrientów w oceanie, pływające mikroby muszą przezwyciężyć wpływ sił fizycznych, w tym dyfuzji molekularnej i ścinania turbulentnego, które ograniczają dostępność plam oraz zdolność bakterii do ich lokalizowania. Do niedawna ograniczenia metodologiczne uniemożliwiały bezpośrednie badania zachowań mikrobów w mozaikowych siedliskach i realistycznych warunkach przepływu w małej skali. W związku z tym znaczna część naszej obecnej wiedzy na temat zachowania mikrobów w oceanie została uzyskana z przewidywań teoretycznych. Aby pozyskać nowe informacje na temat zachowań żerujących mikrobów w oceanie, zastosowaliśmy techniki fabrykacji metodą miękkiej litografii do opracowania dwóch urządzeń mikrofluidycznych, których użyliśmy do stworzenia (i) mikroskalowych plam nutrientów o wymiarach i charakterystyce dyfuzyjnej istotnych dla procesów oceanicznych oraz (ii) mikroskalowych wirów, z szybkościami ścinania odpowiadającymi tym oczekiwanym w oceanie. Urządzenia mikrofluidyczne te umożliwiły pierwszą bezpośrednią analizę pływania i zachowań chemotaktycznych mikrobów w heterogenicznym i dynamicznym krajobrazie morskim. Połączenie mikroskopii epifluorescencyjnej i fazowo-kontrastowej pozwala na bezpośrednie badanie wymiarów fizycznych i charakterystyki dyfuzyjnej plam nutrientów, przy jednoczesnej obserwacji agregacyjnej odpowiedzi na poziomie populacyjnym, a także zachowań pływających poszczególnych mikrobów. Eksperymenty te wykazały, że niektóre gatunki fitoplanktonu, bakterie heterotroficzne i protisty fagotroficzne potrafią sprawnie lokalizować i wykorzystywać dyfundujące mikroskalowe plamy zasobów w bardzo krótkim czasie. Wykazaliśmy również, że przy umiarkowanych szybkościach ścinania bakterie morskie są w stanie przeciwstawić się przepływowi i pływać w swoim środowisku samodzielnie. Jednak powyżej wysokiego progu ścinania bakterie ustawiają się wzdłuż przepływu ścinającego i w mniejszym stopniu są w stanie pływać bez zakłóceń wywołanych przez przepływ. Mikrofluidyka stanowi nowatorskie i niedrogie podejście do badania ekologii mikrobów wodnych i ze względu na możliwość dokładnego tworzenia realistycznych pól przepływu oraz gradientów podłoża w mikroskali, jest idealnie zastosowalna do badań zachowań mikrobów w najmniejszych skalach interakcji. Sugerujemy zatem, że mikrofluidyka stanowi wartościowe narzędzie do lepszego zrozumienia ekologii mikroorganizmów w oceanie.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie

1. Przygotowanie maski 

Za pomocą oprogramowania CAD zaprojektuj kanał do druku o wysokiej rozdzielczości na folii przezroczystej. Będzie to pełnić rolę „maski”.

W pomieszczeniu czystym:

2. Oczyść i wypal wafelek

W pierwszej kolejności opłucz wafelek acetonem, następnie szybko metanolem, a potem izopropanolem. Na koniec osusz wafelek azotem.

Wypiekaj wafle w piekarniku (130°C) przez 5 min.

3. Powlekanie płytki

Umieść wafelek w centrum urządzenia do powlekania wirowego. Wlej fotorezyst (SU-8) z butelki na wafelek. Pozostaw SU-8, aby się rozlał i ustabilizował przez ~ 10 s. Włącz powlekacz wirowy i zwiększaj jego prędkość od 0 do 500 rpm w ciągu 5 s; utrzymuj 500 rpm przez 10 s; zwiększaj prędkość do wartości końcowej w ciągu 10 s i utrzymuj ją przez 30 s. Prędkość końcowa zależy od docelowej grubości powłoki oraz użytego SU-8. Szczegółowe informacje można znaleźć pod adresem http://www.microchem.com/

4. Wygrzewanie wstępne (soft-bake)

Po pokryciu wafla, wypiecz go najpierw w temperaturze 65°C, a następnie w 95°C. Czas wypiekania zależy od docelowej grubości oraz rodzaju zastosowanego fotorezystu. Następnie pozostaw wafla w temperaturze pokojowej na co najmniej 5 min.

5. Ekspozycja

Umieść maskę na powierzchni wafla i naświetlaj wafel światłem UV przez czas zalecany w instrukcji SU-8.

6. Wygrzewanie po naświetlaniu

Wypiecz wafelek w temperaturze 65°C, a następnie w 95°C, zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi SU-8.

7. Wywoływanie wafla w celu uzyskania „matrycy” (formy)

Przygotuj zlewkę wypełnioną wywoływaczem (PMMA). Zanurz wafelek w zlewce, delikatnie nią kołysząc, aż do momentu wymycia nienaświetlonych części fotorezistu.

W naszym laboratorium:

8. Przygotuj PDMS i wlej go na wafer

Wymieszaj PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1 w kubku. Mieszaj do uzyskania homogenicznej konsystencji: spowoduje to powstanie wielu pęcherzyków powietrza i sprawi, że mieszanina stanie się mętna. Wlej mieszaninę na „matrycę”.

9. Odpowietrzanie w komorze próżniowej

Aby usunąć pęcherzyki powietrza, umieść matrycę oraz pokrytą nią mieszaninę PDMS w komorze próżniowej aż do całkowitego ich zniknięcia.

10. Wypiekanie w piekarniku

          Wypiekać przez co najmniej 12 godzin w piekarniku w temperaturze 65°C, aby utwardzić PDMS.

11. Wywierć otwory

Oderwij PDMS od matrycy i wywierć otwory dla wlotów i wylotów kanałów.

W pomieszczeniu czystym (niewidoczne)

12. Bondowanie plazmowe

Kanały są przytwierdzane do szkiełka przedmiotowego po potraktowaniu zarówno warstwy PDMS, jak i szkiełka plazmą tlenową przez 1 min.

Eksperymenty:

Eksperyment nr 1: Badanie odpowiedzi chemotaktycznej mikroorganizmów morskich na mikroprzestrzenne warstwy składników odżywczych

1) Przygotowanie eksperymentu

  1. Wprowadź organizmy i podłoża do szklanych strzykawek
  2. Umieść kanał mikroprzepływowy na stole mikroskopu i podłącz rurki do odpowiednich wlotów i wylotów
  3. Podłącz rurki do zbiornika na odpady. Upewnij się, że rurka jest całkowicie zanurzona w cieczy w zbiorniku na odpady, aby uniknąć oscylacji ciśnienia
  4. Umieść strzykawki w pompie strzykawkowej i podłącz je do zaworów i rurek
  5. Skonfiguruj mikroskop: warunki oświetlenia, powiększenie itp.
  6. Ustaw ostrość na odpowiednią pozycję w kanale
  7. Usuń pęcherzyki powietrza z kanału, używając większej strzykawki wypełnionej sztuczną wodą morską
  8. Ustaw odpowiednią prędkość przepływu w pompie strzykawkowej. W tym przypadku 2 ml/min, co odpowiada średniej prędkości przepływu 220 µm s-1 w kanale

2) Przeprowadzenie eksperymentu

  1. Uruchom pompę strzykawkową, aby ustanowić gradient składników odżywczych w kanale
  2. Po ustabilizowaniu przepływu i utworzeniu się pasma składników odżywczych, zatrzymaj przepływ w pompie strzykawkowej i rozpocznij pomiar czasu od tego momentu
  3. Pasmo składników odżywczych zaczyna dyfundować bocznie
  4. W regularnych odstępach czasu użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zarejestrować sekwencje klatek w celu stworzenia „filmów”
  5. Zidentyfikuj pływające organizmy, wykonując obrazy różnic czasowych między dwiema kolejnymi klatkami, tak aby widoczne były jedynie obiekty ruchome, co pozwoli odróżnić komórki ruchliwe od nieprzesuwających się cząsteczek i szumu tła
  6. Wykonaj filmy, aby określić pozycje komórek w kanale w odniesieniu do położenia obszaru składników odżywczych
  7. Nagrywaj filmy w regularnych odstępach czasu przez 10-20 min, aby przeanalizować pozycje i wzorce pływania organizmów
  8. Wykorzystując oprogramowanie do analizy obrazu do nakładania na siebie pozycji organizmów w różnych klatkach (przypisując każdemu pikselowi maksymalną intensywność światła zarejestrowaną w tym pikselu w czasie trwania filmu), możemy uzyskać informacje o trajektorii pływających komórek 

Eksperyment nr 2: Badanie wpływu sił ścinania na pływające bakterie morskie w wirze

  1. Stosując różne geometrie kanału, możemy obserwować zachowanie bakterii pływających w wirze przy różnych prędkościach ścinania

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie sposobu, w jaki mikroby morskie oddziałują z lokalnym środowiskiem chemicznym i fizycznym, jest niezbędne dla pełniejszego i dokładniejszego postrzegania roli mikroorganizmów planktonicznych w oceanicznych cyklach składników odżywczych i węgla (Azam and Malfatti 2007). Jednak ze względu na małe skale (< mm), w obrębie których zachodzi wiele istotnych interakcji mikrobiologicznych, ograniczenia techniczne uniemożliwiały szczegółowe badania zachowania mikrobów w niejednorodnym krajobrazie biofizykochemicznym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Microsystems Technology Laboratories na MIT za umożliwienie nagrania części tego filmu w zapleczu typu clean room.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PDMS, Sylgard 184Zestaw do elastomeru silikonowegoDow Corninghttp://www.ellsworth.com/sylgard.html
SU8-2100FotorezystMicroChem Corp.www.microchem.com
Odwrócony mikroskop Nikon Eclipse TE2000-EMikroskopNikon Instruments
Przewody PEEK (ID 0,762 mm, OD 1,59 mm)NarzędzieUpchurch Scientificwww.upchurch.com
Strzykawki (z końcówką Luer-Lok)NarzędzieBD Biosciences
Złączka Part P-704-01NarzędzieUpchurch ScientificDo połączenia przewodów ze strzykawkami z końcówką Luer-Lok
Pompa strzykawowa (programowalna PHD 2000)SprzętHarvard Apparatus
Kamera CCD (PCO 1600)SprzętCook

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
  2. Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
  3. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
  4. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
  5. Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
  6. Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
  7. Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
  8. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Urz dzenia mikrofluidyczneplastry od ywczemikroskopia epifluorescencyjnamikroskopia fazowo kontrastowaszybko ci cinaniazachowanie p ywackiewi zanie PDMSsoft litografia

Powiązane artykuły