Elektroporacja organoidów: metoda transfekcji plazmidowego DNA do organoidów przewodu pokarmowego

Streszczenie

Źródło: Gaebler, A. M.et al.Uniwersalny i wydajny protokół elektroporacji dla inżynierii genetycznej organoidów przewodu pokarmowego. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film opisuje protokół elektroporacji do transfekcji dużych plazmidów do trójwymiarowych organoidów przewodu pokarmowego, aby udowodnić jego uniwersalną funkcjonalność w różnych jednostkach, a mianowicie w organoidach gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC), raka jelita grubego (CRC), raka dróg żółciowych (CCC) i raka żołądka (GC).

Protokół

1. Hodowla organoidów i preparaty przed elektroporacją

1. Ustalić organoidy przez trawienie tkankowe, jak opisano wcześniej, i rozwinąć je za pomocą odpowiadającej im pożywki hodowlanej specyficznej dla danej jednostki w przeglądzie macierzy podstawowej, patrz Tabela 1 i Tabela materiałów
   nuta: W przypadku próbek tkanek ludzkich konieczna jest świadoma zgoda i zatwierdzenie badania przez komisję etyczną.
2. Wstępnie rozgrzej 48-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C do wysiewu po elektroporacji.
3. Przygotować pożywkę podstawową bez antybiotyków, jak również pożywkę do hodowli organoidów specyficzną dla danej jednostki bez antybiotyków (patrz Tabela 1), w tym 10 μM Y-27632 i 3 μM CHIR99021,
   nuta: Wycofanie antybiotyków jest ważne w celu zmniejszenia skutków toksycznych. Y-27632 i CHIR99021 poprawić regenerację komórek.
4. Przygotowanie organoidów (patrz rysunek 1)
   1. Hodować 5 dołków organoidów na 48-dołkowej płytce na próbkę do elektroporacji w pożywce hodowlanej.
      nuta: Należy stosować organoidy rozchodzące się (około 2-3 dni po ostatnim rozszczepieniu).
   2. Przygotować 230 μl odczynnika dysocjacyjnego (patrz tabela materiałów), w tym 10 μM Y-27632 na studzienkę.
   3. Usunąć pożywkę hodowlaną z każdej studzienki i mechanicznie rozdzielić organoidy w 230 μl przygotowanej mieszaniny dysocjacyjnej. Zebrać 5 studzienek na próbkę do elektroporacji w jednej probówce o pojemności 15 ml.
   4. Mieszać przez wirowanie i inkubować przez 5-15 minut w temperaturze 37 °C, aż do powstania skupisk 10-15 komórek. Dlatego sprawdź dysocjację pod mikroskopem. Zatrzymaj trawienie, dodając podłoże podstawowe bez antybiotyków do 10 ml.
      nuta: Ten krok jest bardzo ważny! Wydajność elektroporacji zostanie zmniejszona, gdy inkubacja będzie zbyt krótka, ale długie trawienie zmniejszy przeżywalność.
   5. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i przemyć dwukrotnie 4 ml buforu do elektroporacji (patrz tabela materiałów).

2. Elektroporacja

UWAGA: Następujący protokół został opracowany dla elektroporatorów zdolnych do wykonywania fal prostokątnych oraz oddzielnych sekwencji impulsów poringowych i transferowych (patrz Rysunek 2). Opcjonalnie wartości impedancji, a także napięcia, prądy i energie przenoszone do próbki mogą być mierzone jako kontrola dla powtarzalnych eksperymentów.

1. Zawiesić osad organoidowy w 100 μl buforu do elektroporacji (patrz tabela materiałów) zawierającego 30 μg plazmidowego DNA.
   nuta: Stężenie zastosowanego plazmidowego DNA powinno przekraczać 5 μg/μl dla optymalnego stężenia soli podczas procesu elektroporacji. Dlatego do przygotowania wektorów zaleca się endofree plasmid maxi kit (patrz tabela materiałów). Łącznie można użyć do 45 μg DNA bez działania cytotoksycznego.
2. Dozować kompletną mieszaninę DNA-organoid do kuwety elektroporacyjnej o szerokości szczeliny 2 mm bez wytwarzania pęcherzyków powietrza.
3. Ustaw parametry elektroporacji (patrz Tabela 2, Rysunek 2).
4. Lekko wymieszaj komórki bez spieniania, stukając palcem w kuwetę. Umieść kuwetę w komorze kuwety.
5. Naciśnij przycisk Ω elektroporatora i zanotuj wartość impedancji.
   nuta: Impedancja między 30-40 Ω dała najlepsze wyniki. Ogólnie rzecz biorąc, powinien mieścić się w przedziale 30-55 Ω. Jeśli tak nie jest, należy sprawdzić następujące aspekty: szerokość szczeliny zastosowanej kuwety, połączenia kablowe elektroporatora, ewentualne pęcherzyki powietrza, prawidłowa objętość i stężenie soli w mieszaninie do elektroporacji.
6. Naciśnij przycisk Start, aby uruchomić program elektroporacji i kontrolować wyświetlane wartości prądów, napięć i energii.
   nuta: Wartości mierzonych napięć, prądów i energii powinny odpowiadać ustawionym parametrom elektroporacji. W celu porównania powtarzających się eksperymentów pomocne może być zanotowanie tych danych.
7. Po elektroporacji natychmiast dodać 500 μl pożywki hodowlanej bez antybiotyków (z CHIR99021 i Y-27632; patrz krok 1.3). Mieszać, pipetując w górę i w dół, aby oddzielić białą pianę.
   nuta: Biała piana pojawia się po procesie elektroporacji i przyłącza się do niej znaczna liczba ogniw. Tak więc dysocjacja jest bardzo ważna, aby nie tracić komórek.
8. Przenieść próbkę całkowicie z kuwety do nowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety należącej do kuwet do elektroporacji (patrz tabela materiałów). Zaleca się ponowne przepłukanie kuwety podłożem podstawowym w celu uzyskania pozostałych komórek.
9. W celu regeneracji komórek inkubuj je przez 40 minut w temperaturze pokojowej.

3. Zasiewanie komórek

1. Odwirować komórki o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
2. Zawiesić osad w 100 μl matrycy podstawowej i wysiać 20 μl kropli na wstępnie ogrzanej 48-dołkowej płytce (patrz krok 1.2). Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w celu polimeryzacji i dodać 250 μl pożywki hodowlanej, którą uzupełnia się Y-27632 i CHIR99021 do następnego podziału wyhodowanych organoidów (około 5-7 dni).

4. Określanie efektywności transfekcji

UWAGA: Generalnie, zaleca się elektroportowanie wektora ze znacznikiem fluorescencji jako dodatkową kontrolę transfekcji. W zależności od wybranego markera i jego dojrzałości chromoforu, fluorescencja będzie widoczna w ciągu około 24-48 godzin po transfekcji18.

1. Sprawdź fluorescencję pod mikroskopem po 24-48 godzinach w kontroli transfekcji (rysunek 3B)

Tabela 1: Skład podłoża podstawowego, mieszaniny mineralizacyjne i podłoża uprawowe.

Składniki podłoża podstawowego:	ja	Ii
Zaawansowany DMEM/F-12	-	-
Glutamax (Glutamax)	1x	1x
Hepes	10 mM	10 mM
Penicylina Streptomycyna	-	1x
Primocin	1x	-

Ustalanie przez trawienie
Mieszanka trawienna:	dwukropek		Żołądek		Wątroba		Trzustka
	normalny	guz	normalny	guz	normalny	guz	normalny	guz
Kolagenaza II	-	-	-	-	-		0,625 mg/ml
Kolagenaza XI	-	0,1 mg/ml	-	0,1 mg/ml	-		-
Kolagenaza D	-	-	-	-	2,5 mg/ml		-
Dypaza II	-	1 mg/ml	-	1 mg/ml	-		2,5 mg/ml
DNaza I	-	-	-	-	0,1 mg/ml		-
Edta	2 mln	-	10 mM	-	-		-
Rozcieńczony w	Bufor chelatujący*	Podłoże podstawowe I	Bufor chelatujący*	Podłoże podstawowe I	w EBSS		Podłoże podstawowe I
Inkubacja dla:	0,5 h na lodzie	1h w 37°C	0,25-0,5 h przy dużym natężeniu ruchu	1h w 37°C	0,5-1 h w 37°C	1,5 h w temperaturze 37°C	0,5-1 w 37°C	2-3 h w temperaturze 37°C
Na podstawie referencji:	Sato et al. 2011		Bartfeld i in. 2015		Broutier et al. 2016		Hennig i in. 2019

powiedział:

Podłoże uprawowe (Podstawowe: Podłoże podstawowe II)
A83-01	0,5 μM	2 μM	5 μM	0,5 μM
B27	1x	1x	1x	1x
B27 bez witaminy A	-	-	1x	-
Forskolina	-	-	10 μM	-
hFGF-10	-	200 ng/ml	100 ng/ml	100 ng/ml
hHGF powiedział:	-	-	25 ng/ml	-
[Leu15] Gastrin	10 nM	1 nM	10 nM	10 nM
Fundusz mEFG	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml
N2	-	-	1x	-	1x
N-acetylo-L-cysteina	1,25 mM	1 mM	1 mM	1 mM
Nikotynamid	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
Kubek	10 %	10 %	-	10 %
Primocin	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)
Prostaglandyna E2	10 nM	-	-	-	1 μM
Rspondyna	20 %	10 %	10 %	10 %
SB202190	3μM	-	-	-
Wnt3A	50 %	50 %	-	50 %
*Bufor chelatujący: 5,6 mM Na2HPO4, 8,0 mM KH2PO4, 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 43,4 mM sacharoza, 54,9 mM d-sorbitol, 0,5 mM dl-ditiotreitol w wodzie destylowanej

Wyniki

Rysunek 1: Proces przygotowania elektroporacji. Po pierwsze, organoidy powinny zostać zdysocjowane na klastry 10-15 komórek, a antybiotyki powinny zostać wypłukane. Po elektroporacji biała piana musi zostać zdysocjowana. Komórki mo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
[Leu15] Gastrin	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G9145
A83-01	Tocris Bioscience	Numer katalogowy: 2939
Zaawansowany DMEM/F-12	Invitrogen	12634010
B27	Invitrogen	17504044
Suplement witaminy B27 bez witaminy A	Thermo Fisher Naukowy	12587010
CHIR99021	Stemgent (Łodyga	04-2004
Kolagenaza II	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 17101-015
Kolagenaza XI	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C9407-100MG
Kolagenaza D	Roche	11088866001
Dypaza II	Roche	4942078001
Dnaza I	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D5319
D-sorbitol	Roth	Zobacz materiał 6213.1
Ditiotreitol	Thermo Scientific	1859330
Edta	Roth	Numer katalogowy 8040
Forskolina	Tocris Bioscience	Numer katalogowy 1099
Glutamax (Glutamax)	Technologie życiowe	35050061
Hepes	Thermo Fisher Naukowy	15630106
hFGF-10	Preprotech	100-26
Kcl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P9541
KH2PO4	Roth	3904.2
Matrigel	Corning	356231	matryca piwniczna
Fundusz mEFG	Invitrogen	PMG8043
N2	Invitrogen	17502048
Zawartość NaCl	Roth	3957.1
Na2HPO4	Roth	Zobacz materiał K300.2
N-acetylo-L-cysteina	Sigma-Aldrich	A9165
Nikotynamid	Sigma-Aldrich	N0636
Kubek	nie dotyczy	nie dotyczy	Kondycjonowana pożywka wytwarzana z komórek HEK293 (Hek293- mNoggin-Fc)
Rekombinowany ludzki HGF	Preprotech	100-39 godz.
Rspondyna	nie dotyczy	nie dotyczy	Kondycjonowana pożywka wytwarzana z ogniw HEK293 (HA-Rspo1- Fc-293T)
SB202190	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7067
TrypLE Ekspresowy	Gibco (firma Gibco)	12604021	Odczynnik dysocjacyjny
Wnt3A	nie dotyczy	nie dotyczy	Kondycjonowana pożywka wytwarzana z komórek L-Wnt3a (od Sylvia Boj)
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Płytka 48-dołkowa	Corning	3548
Kuwety do elektroporacji Nepa Szczelina 2 mm z pipetami	Nepa Gene Co., Sp. z o.o.	EC-002S
Elektroporator Nepa21	Nepa Gene Co., Sp. z o.o.	nie dotyczy
EVOS FL Automatyczny	Invitrogen	AMAFD1000	Mikroskop fluorescencyjny
EndoFree Plasmid Maxi Ki	Qiagen powiedział:	Numer katalogowy: 12362
Opti-MEM	Gibco (firma Gibco)	31985047	Bufor do elektroporacji
Wektor konkategorujący 2 gRNA	AddGene (Dodatek Genetyczny)	Numer katalogowy: 84879
Plazmid PX458	AddGene (Dodatek Genetyczny)	Numer katalogowy: 48138	kodowanie dla sgRNA i Cas9
px458_Conc2 plazmid	AddGene (Dodatek Genetyczny)	134449	plazmid px458 zawierający 2x promotory U6 dla dwóch różnych sgRNA

) TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: (wersja angielska) powiedział: powiedział: SZT.