1. Trawienie guzów trzustki
- Umieść wypreparowany guz trzustki, guzy w miejscu przerzutów lub zdrową tkankę trzustki w lodowatym PBS i przechowuj na lodzie.
- Użyj kleszczy, aby przenieść guz na szalkę Petriego.
- Dodać 5,0 ml pożywki wytrawiającej (2 mg/ml kolagenazy, 0,025 mg/ml DNazy RPMI) do probówki o pojemności 50 ml; przechowywać na lodzie, aby zapobiec rozpoczęciu aktywności enzymów.
nuta: W protokole tym wykorzystuje się kolagenazę typu V, która ma aktywność ≥1 jednostek/mg FALGPA i > 125 jednostek trawienia kolagenu (CDU)/mg ciała stałego. Podwielokrotności kolagenazy i DNazy można przechowywać w temperaturze -20 °C i rozmrażać na lodzie przed użyciem. Gdy oba są całkowicie rozpuszczone w sterylnym RPMI, można je przepuścić przez filtr 0,2 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń. Kolagenaza musi być całkowicie rozpuszczona przed filtrowaniem, aby uniknąć utraty materiału.
- Weź małą porcję tego roztworu, aby pokryć guz na szalce Petriego.
- Użyj sterylnego skalpela i kleszczy, aby pociąć guz na małe kawałki o długości mniej niż 3 mm.
- Zeskrob kawałki guza do probówki i delikatnie odwróć rurkę, aż wszystkie kawałki zostaną zanurzone w pożywce trawiącej. Przechowywać na lodzie, jeśli konieczne jest przygotowanie innych próbek guza w partii.
- Przenieść na urządzenie wstrząsające na 20 minut w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że wszystkie kawałki guza są zanurzone i nie przyklejają się do krawędzi rurki. Jeśli wstrząsanie nie jest możliwe, należy wirować próbkę co 5 minut, aby wspomóc trawienie.
2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z strawionego guza
- Natychmiast po etapie trawienia umieść probówkę na lodzie, aby spowolnić aktywność enzymu.
- Dodaj EDTA, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mM i krótko zawiruj próbkę do wymieszania. To jeszcze bardziej spowolni aktywność enzymu.
- Otwórz probówkę i spłucz wszelkie odpady trawione przez guz z pokrywki probówki świeżym medium RPMI.
- Przygotuj sitko o pojemności 70 μm (rozmiar sitka w μm można dowolnie zmieniać) na otwartej probówce o pojemności 50 ml na lodzie.
- Wstępnie zwilż filtr medium.
- Ponownie zawiesić strawione komórki i umyć boki probówki za pomocą pasiaka o pojemności 25 ml lub większej. Szerszy otwór pasiaka jest ważny, aby umożliwić łatwe przejście gęstego trawienia.
- Przenieś cały płyn za pomocą paski o pojemności 25 ml na sitko.
- Rozgnieć guz na wierzchu filtra za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml. Zacieraj tylko bezpośrednio w górę iw dół, aby zminimalizować naprężenia ścinające komórki.
- Ciągle myj komórki przez sitko za pomocą RPMI. Upewnij się, że myjesz z wystarczającą siłą, aby przepchnąć komórki.
- Jeśli nadal jest materiał do zacierania, ale RPMI przestaje się przepłukiwać, sitko zostanie nasycone. Dlatego przenieś próbkę do nowego filtra i kontynuuj.
nuta: Ostatecznie w filtrze pozostaną tylko składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, przez które powinny przejść wszystkie pojedyncze komórki.
- Wirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy w pełnym RPMI i przejść bezpośrednio przez inny filtr, aby usunąć wszelką macierz zewnątrzkomórkową lub duże grudki komórek, których nie można odpowiednio zawiesić.
- W tym momencie, jeśli stymulacja nie jest wymagana, natychmiast wyizolowane komórki należy wybarwić do analizy metodą cytometrii przepływowej, pomijając odwirowanie płytki przez 5 minut przy 300 x g i temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, przesuwając płytkę do góry nogami jednym ostrym ruchem. Alternatywnie, zawiesić je ponownie w pożywce zamrażającej (10% DMSO w FBS) i przechowywać w temperaturze -80 °C, a następnie długotrwale przechowywać w ciekłym azocie.
nuta: Etap zamrażania może pozwolić na oczyszczenie komórek odpornościowych w późniejszym terminie; Jednak kwantyfikacja podzbiorów komórek odpornościowych może wymagać optymalizacji w celu potwierdzenia, że proces zamrażania/rozmrażania nie ma wpływu na liczbę komórek i fenotyp. Stymulację limfocytów T ex vivo najlepiej wykonywać na świeżych próbkach guza. W tym momencie próbka może być dalej oczyszczana przez usuwanie martwych komórek na podstawie kulek lub testy wzbogacania komórek odpornościowych, jeśli jest to wymagane.
3. Przygotowanie komórek do stymulacji ex vivo
- Policz komórki, aby osiągnąć stężenie 2 x 106/ 100 μL w kompletnym pożywce (RPMI 10 % FBS, 1X penicylina i 1 X streptomycyna).
nuta: Duża liczba wszystkich posianych komórek zapewnia, że w tej próbce będzie wystarczająca ilość limfocytów T do analizy. Jednak liczbę tę można skalować w górę lub w dół w zależności od dostępności próbki i rzadkiego charakteru podzbiorów limfocytów T, które są przedmiotem zainteresowania.
- Umieść 100 μl komórek na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U.
- Dodać 100 μL kompletnej pożywki zawierającej 2x preparat PMA/ jonomycyny (w celu uzyskania końcowego stężenia odpowiednio 0,081 μM i 1,34 μM, zgodnie z zaleceniami producenta).
nuta: Jeśli mierzysz degranulację/egzocytozę, uwzględnij tutaj również fluorescencyjnie sprzężony anty-mysi CD107a w pożywce. Należy również pobrać próbkę kontrolną, która nie zawiera CD107a.
- Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 1 godzinę.
- Dodać 20 μL 10x preparatu brefeldyny A i monenzyny (do uzyskania końcowego stężenia odpowiednio 1,06 μM i 2,0 μM (zgodnie z zaleceniami producenta) w kompletnych pożywkach.
nuta: Brefeldyna A i monenzyna są inhibitorami transportu białek, a tym samym blokują zewnątrzkomórkowe uwalnianie cytokin itp., umożliwiając ich wykrycie za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku pomiaru uwalniania cytokin do supernatantu za pomocą testu ELISA lub podobnych metod – ten krok można pominąć.
- Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na kolejne 4 godziny.
