Obrazowanie dynamiki wapnia w komórkach trzustki: technika badania zmian w czasie rzeczywistym stężenia wapnia cytozolowego w wyspach trzustkowych

Streszczenie

Źródło: Hamilton, A., et al. Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje technikę obrazowania komórek wysp trzustkowych w czasie rzeczywistym, w celu zbadania zmian w stężeniu wapnia cytozolowego w mniejszych subpopulacjach komórek wysp trzustkowych. Mniejsze subpopulacje komórek można zidentyfikować za pomocą funkcjonalnych odpowiedzi na związki markerowe, takie jak adrenalina i grelina, które indukują zmiany w cytozolowym wapniu w określonych populacjach komórek wysp trzustkowych. Może to zapewnić wgląd w wzajemne oddziaływanie między poziomem glukozy we krwi a wydzieliną wysp trzustkowych.

Protokół

1. Załaduj barwnik lub odciągnij czujnik

1. Przygotuj barwnik, który można złapać.
   1. Rozpuścić podwielokrotność (zwykle 50 μg) barwnika wychwytywalnego (np. Fluo-4) w DMSO do stężenia podstawowego 2 mM. Dodaj kwas pluronowy do końcowego stężenia 1% (używając 20% zapasu w DMSO), aby poprawić rozpuszczalność barwnika.
   2. Barwnik należy podzielić na porcje w małych probówkach do PCR (po 2 μl w każdej). Barwnik można przechowywać w stanie zamrożonym (-20 °C) przez kilka tygodni.
2. Alternatywnie należy przygotować rekombinowany czujnik.
   1. Rozprowadzić czujnik (np. wektor adenowirusowy kodujący GCaMP6f) w 10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   2. (Opcjonalnie) należy wstępnie przetestować miano stada wirusa, infekując wyspy trzustkowe (jak poniżej) przy użyciu kilku seryjnych rozcieńczeń, aby ujawnić optymalne stężenie dla infekcji.
      nuta: Rekombinowane czujniki kodowane przez różne wektory (lentiwirus, BacMam, AAV) wymagają innego protokołu infekcji. Upewnij się, że sprawdziłeś to u dostawcy wektorów i zoptymalizuj współczynnik roboczy do swoich potrzeb. "Zapas roboczy" adenowirusa może być przechowywany w temperaturze -20 °C i kilkakrotnie zamrażany/rozmrażany. Nadmierne cykle zamrażania i rozmrażania zmniejszają efektywne miano wirusa.
3. Przygotuj roztwór do obrazowania.
   1. Uzupełnić roztwór do obrazowania, mM: 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl₂, 1,2 MgCl₂, 1 NaH₂PO₄, 5 NaHCO₃, 10 HEPES (pH 7,4, z NaOH).
   2. Uzupełnić zapas glukozy (0,5 M) i mannitolu (0,5 M) w roztworze do obrazowania. Wywar można przechowywać w lodówce (4 °C) przez kilka tygodni.
4. Załaduj barwnik, który można złapać.
   1. Uzupełnić roztwór roboczy barwnika, rozpuszczając 2 μl barwnika w 600 μl roztworu do obrazowania zawierającego 6 mM glukozy. Roztwór można podgrzać lub wirować w celu poprawy rozpuszczalności.
   2. Załaduj izolowane wysepki do roztworu roboczego barwnika. Ładowanie można wykonać za pomocą płytki wielodołkowej lub szalki Petriego. W tym drugim przypadku należy umieścić 100 μl kropli roztworu roboczego na dnie nieprzylepnej szalki Petriego (35 lub 60 mm) i odpipetować 10-30 wysepek do kropli.
   3. W przypadku różnych grup wysepek (np. typu dzikiego/knock-out) należy rozmieścić wiele studzienek i wiele kropel, aby załadunek mógł odbywać się jednocześnie.
   4. Inkubować wysepki w roztworze roboczym barwnika w temperaturze pokojowej w ciemności przez 70-90 minut. Nie przesadzaj z inkubacją.
   5. Sprawdź obciążenie pod mikroskopem fluorescencyjnym; wysepki powinny uzyskać łagodną fluorescencję, przy czym niektóre komórki powinny być jaśniejsze niż reszta. Zaokrąglanie komórek i lokalizacja jądrowa barwnika są oznakami przeciążenia.
   6. Przenieść wyspy trzustkowe do bezbarwnikowego roztworu do obrazowania zawierającego 6 mM glukozy. Wysepki można natychmiast wykorzystać do obrazowania, ale opcjonalnie barwnik można pozostawić do deestryfikacji na kolejne 10-15 minut. Wysepki zatrzymują barwnik przez kilka godzin i dlatego mogą być używane do obrazowania na kilka zmian.
5. Alternatywnie należy zainfekować wysepki wektorem rekombinowanym.
   1. Płytki wysepkowe w kropelkach w pożywce hodowlanej RPMI (RMPI1640 (patrz tabela materiałów), uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęcej, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny. Dozować pożywkę do dwóch plastikowych szalek Petriego o średnicy 60 mm (niepokrytych żadnym klejem) i przechowywać szalki w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂, wilgotność bezwzględna)). (np. 30 μL), aby zminimalizować potrzebną objętość wektora.
   2. Dodaj wektor w stosunku około 10⁵ jednostek zakaźnych na wyspę, co powinno idealnie skutkować mnogością infekcji >2. Idealnie byłoby, gdyby stosunek był zoptymalizowany do minimalnego stosunku, który zapewniałby ekspresję w warstwie obwodowej. Pomocne może być wstępne miareczkowanie (krok 1.2.2).
   3. Wprowadź 20-50 wysepek do kropli i hoduj przez 8-48 godzin. (Najlepiej z dnia na dzień). Wyspy trzustkowe powinny rozwinąć słabą zieloną fluorescencję w większości komórek, bez zmian w morfologii komórek.
      nuta: Powodzenie infekcji i ekspresja zależy od czasu ekspozycji na roztwór wirusa. Idealnie byłoby, gdyby wirus pozostał w roztworze przez noc, ale opcjonalnie można go usunąć już po 15 minutach. Jednak zakaźność, a co za tym idzie ekspresja, będzie prawdopodobnie znacznie niższa.

2. Obrazowanie dynamiki Ca²⁺

1. Unieruchomić wysepki pod (odwróconym) mikroskopem.
   1. Zmontuj komorę obrazowania do mikroskopii odwróconej. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe (grubość 1 lub 1,5) wewnątrz komory i upewnij się, że interfejs szklanej komory jest wodoszczelny. Sprawdź, czy szkiełko nakrywkowe znajduje się w zasięgu obiektywu mikroskopu (krytyczne w przypadku nieporęcznego obiektywu o wysokim NA).
   2. Przygotuj akcesoria do unieruchamiania. Wytnij małe prostokąty (20 mm x 20 mm) z drobnej siatki i grubych oczek. Wprowadź dwie "ścianki" dystansowe na drobną siatkę za pomocą taśmy klejącej o grubości 45-50 μm. Należy użyć podwójnych warstw przekładki, jeśli rozmiar wysepek, które mają być zobrazowane, znacznie przekracza konwencjonalne 100 μm.
   3. Zanurz siatki i ciężar w roztworze do obrazowania za pomocą szalki Petriego o średnicy 35 mm. Upewnij się, że plastik i metal są mokre.
   4. Pod mikroskopem preparacyjnym obróć drobną siatkę ze "ściankami" przekładki do góry nogami, przekładkami skierowanymi do góry. Pobrać kilka wysepek załadowanych barwnikiem wychwytywanym lub odciągających rekombinowaną elektrodę za pomocą pipety P20 i delikatnie umieścić je na wierzchu drobnej siatki, między dwoma przekładkami. Upewnij się, że na siatce i podkładkach nie ma nadmiernych ilości roztworu do obrazowania.
   5. Podnieś siatkę z wysepkami za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich i umieść ją do góry nogami w komorze obrazowania, tak aby przekładki były skierowane w dół i przylegały bezpośrednio do szkiełka nakrywkowego komory. Upewnij się, że wysepki są uwięzione między przekładkami a siatką w środku szkiełka nakrywkowego.
   6. Umieść grubą siatkę i ciężarek na wierzchu drobnej siatki w komorze. Wprowadzić roztwór do obrazowania do komory. Upewnij się, że wysepki są unieruchomione i gotowe do obrazowania. Unikaj nadmiernego potrząsania komorą (dopuszczalne są drobne zakłócenia, takie jak przenoszenie komory do mikroskopu i wkładanie do podgrzewanego sceny).
      nuta: Podobny układ unieruchomienia można zastosować w przypadku systemu pionowego.
2. Ustaw mikroskop.
   1. Wybierz tryb obrazowania i obiektyw, ustaw komorę z wysepkami z kroku 2.1 na stoliku mikroskopu z kontrolowaną temperaturą.
      1. Ustaw regulację temperatury (najlepiej między 30 °C a 36 °C) i perfuzję. W przypadku systemu odwróconego należy ustawić dopływ poniżej odpływu w komorze i ustawić strumień odpływu na większy niż strumień dopływu (co zwykle osiąga się za pomocą rurki o szerszej średnicy wewnętrznej w pompie perystaltycznej).
      2. Upewnij się, że odpływ ma minimalną powierzchnię kontaktu z roztworem, tak aby usuwał roztwór w wielu sekwencyjnych małych kropelkach, unikając długich przerw ciągłego usuwania roztworu. To ostatnie jest głównym źródłem artefaktów w obrazowaniu poklatkowym sygnałów okresowych, ponieważ pojawiają się one jako regularne okresowe oscylacje intensywności każdego obrazowanego piksela i są często interpretowane jako "wolne fale".
      3. Rozpocząć perfuzję roztworem do obrazowania zawierającym 3 mM glukozy.
   2. Wybierz ścieżkę światła i filtry do obrazowania zielonych fluoroforów; wzbudzenie między 470 a 500 i emisja między 505 a 550 będą działać dla każdego z nich.
   3. Uruchom obrazowanie na żywo, aby skonfigurować parametry obrazowania. Dostosuj widok, aby uchwycić interesujące Cię wysepki.
   4. Zoptymalizuj stosunek sygnału do szumu obrazu. W tym celu dostosuj natężenie światła wzbudzenia, czas ekspozycji i binning. Upewnij się, że ustawienia pozwalają na odrębną wizualizację każdej komórki w wysepce przy minimalnym możliwym natężeniu światła i ekspozycji.
   5. Wykonaj akwizycję obrazu. W zależności od zadania zdjęcia mogą być wykonywane z częstotliwością od 0,1 do 5 Hz. Jest to znacznie poniżej kryteriów Nyquista dla szybkich oscylacji sterowanych przez Na⁺ w komórkach α i δ (>300 Hz), co oznacza, że dane są domyślnie niedostatecznie próbkowane. Jednak zwiększenie częstotliwości akwizycji w celu dopasowania do tego zapotrzebowania nie jest możliwe w obrazowaniu wielokomórkowym/wielowyspowym z dużym polem widzenia. GCaMP może być obrazowany szybciej, podczas gdy Fluo4 nieuchronnie wybiela się w warunkach szybkiej akwizycji.
      nuta: Biorąc pod uwagę, że oscylacje [Ca^{2 +}] _cyt w komórkach wysp trzustkowych są napędzane przez aktywność elektryczną, stosowanie niskich wskaźników akwizycji może wydawać się przeciwne do zamierzonego. W rzeczywistości jednak szybkość akwizycji przy około lub powyżej 1 Hz może być wystarczająca do rozwiązania zachowania impulsowego komórek β, podczas gdy próg wykrywania oscylacji napędzanych kanałem sodowym w komórkach α i δ jest znacznie powyżej 300 Hz. Niezależnie od tego, czy oscylacje cyt w α czy δ-komórkowych [Ca^{2 +}] _są rejestrowane przy 1 Hz czy 0,1 Hz, będą one poważnie niedopróbkowane i będą odzwierciedlać obchodzenie się z Ca²⁺ przez komórkę, a nie aktywność elektryczną.
      1. Sprawdź jakość uzyskanych danych: przy 3 mM glukozy aktywność komórek α powinna być wyraźnie widoczna/wykrywalna. Upewnij się, że tak jest i przejdź do pełnowymiarowego obrazowania poklatkowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Obiektyw 40x/1,3
GCaMP6f, w wektorze adenowirusowym (typ ludzki 5)	Wektor Biolabs	Rok 1910
Surowica bydlęca płodu	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
Średnie prędkości obrotowe	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
penicylina/streptomycyna	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
Mikroskop Axiovert 200
Fluo4	Thermo Fisher (Technologie Życia)	F14201