Pierwotna izolacja komórek groniastych: metoda izolowania komórek groniastych z trzustki myszy

Streszczenie

Źródło: Fleming Martinez, A. K., et al. Naśladowanie i manipulowanie metaplazją międzyprzewodową trzustki w trójwymiarowej hodowli komórek. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje technikę używaną do izolowania komórek groniastych trzustki - komórek zewnątrzwydzielniczych - zawierających różne enzymy trawienne. Pierwotne komórki groniaste są przydatne w badaniu ex vivo metaplazji wylotkowo-przewodowej (ADM) - wczesnego zdarzenia w rozwoju raka trzustki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami i komisję rewizyjną Jove Veterinary Review Board.

1. Izolacja komórek groniastych

1. Poświęć mysz poprzez indukcję CO ₂ i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy. Natychmiast wypreparuj trzustkę. Aby wypreparować trzustkę, najpierw przypnij łapy myszy do polistyrenowej pokrywy, ustaw mysz tak, aby ogon był skierowany w stronę badacza i spryskaj brzuch 70% etanolem.
   nuta: Mysz użyta w reprezentatywnych wynikach była 12-tygodniową nietransgeniczną samicą o pochodzeniu C57BL/6. Wybór myszy jest bardziej szczegółowo omówiony w sekcji dyskusji.
   1. Używając zestawu autoklawowanych nożyczek i kleszczy, podnieś futro/skórę kleszczami na linii środkowej i użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie przez futro i skórę od otworu cewki moczowej do obszaru przepony/klatki piersiowej.
   2. Wykonaj dodatkowe nacięcia po lewej i prawej stronie, tak aby futro/skóra została odcięta, aby uzyskać wyraźny widok jamy brzusznej. Następnie wciąć w błonę śluzową otrzewnej (w dół pośrodku oraz w prawo i w lewo) i odciągnąć ją od narządów, tak jak to miało miejsce w przypadku futra/skóry.
   3. Podnieś jelita kleszczami i połóż je po lewej stronie myszy, tworząc przestrzeń, aby zobaczyć trzustkę, która jest koloru jasnoróżowego i przyczepiona do śledziony, która jest ciemnoczerwonym owalem. Tkanka trzustki wyróżnia się miękką, gąbczastą teksturą. Wytnij trzustkę, która będzie biegła wzdłuż żołądka i przeplatała się z jelitami.
   4. Oddziel śledzionę od trzustki. Następnie umieść trzustkę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml HBSS z 1x penicyliną-streptomycyną i przynieś ją do okapu z przepływem laminarnym.
      nuta: Pozostałe etapy protokołu powinny być wykonane przy użyciu sterylnej techniki w okapie z przepływem laminarnym.
2. Wlej trzustkę i HBSS (z penicyliną-streptomycyną) do pustej łodzi wagowej i za pomocą kleszczy umyj trzustkę, obracając ją. Następnie przenieś trzustkę z kleszczami do drugiej łodzi ważącej zawierającej HBSS (z penicyliną-streptomycyną). Ponownie umyj trzustkę, obracając.
3. Przenieść trzustkę do trzeciej łodzi wagowej zawierającej HBSS (z penicyliną-streptomycyną) i rozpocząć cięcie trzustki na małe kawałki o średnicy 5 mm lub mniejszej. Następnie wlej kawałki trzustki i HBSS do pustej probówki o pojemności 50 ml.
   1. Aby to zrobić, użyj kleszczy, aby przesunąć kawałki trzustki do płynu podczas przechylania łodzi wagowej. Wlej, gdy wszystkie kawałki nie są już przymocowane do łodzi wagowej. Zebrać wszystkie pozostałe kawałki za pomocą kleszczyków i umyć kleszcze w 50 ml probówce zawierającej trzustkę w HBSS z penicyliną-streptomycyną.
4. Wirować przy 931 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć HBSS (i wszelki tłuszcz, który się unosi), pipetując go pipetą o pojemności 5 ml.
5. Dodaj 5 ml kolagenazy (Przygotuj 40 ml HBSS + 5% FBS, 20 ml HBSS + 30% FBS i 5 ml kolagenazy 2 mg/ml w HBSS. Wysterylizuj kolagenazę przez filtrację (pory 0,22 μm) i przechowuj w temperaturze pokojowej. Trzymaj każdy z roztworów HBSS na lodzie) do trzustki. Owijając probówkę o pojemności 50 ml plastikową folią parafinową, należy upewnić się, że jest szczelnie zamknięta, a następnie umieścić ją w inkubatorze, wstrząsając z prędkością 220 obr./min przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
   nuta: Czas trawienia kolagenazy może się różnić, jak zauważono w dyskusji. Pod koniec inkubacji nie powinny pozostać żadne duże kawałki tkanki.
6. Aby zatrzymać dysocjację, umieść rurkę zawierającą trzustkę na lodzie i dodaj 5 ml zimnego HBSS + 5% FBS. Wirować przy 931 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie odpipetować supernatant za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
7. Zawiesić w 10 ml HBSS + 5% FBS i odwirować przy 931 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odpipetować supernatant za pomocą pipety o pojemności 5 ml i powtórzyć ten krok z kolejnymi 10 ml HBSS + 5% FBS.
8. Zawiesić ponownie w 5 ml HBSS + 5% FBS i za pomocą P1000 przenieść 1 ml na raz przez siatkę 500 μm do probówki o pojemności 50 ml. Dodaj dodatkowe 5 ml HBSS + 5% FBS przez siatkę z P1000, aby przemyć pozostałe komórki trzustki przez siatkę.
9. Zawiesinę komórek z siatki 500 μm przepuścić przez siatkę 105 μm, pipetując po 1 ml za pomocą P1000. Następnie delikatnie odpipetować zawiesinę komórkową do probówki zawierającej HBSS + 30% FBS. Na górze utworzy się warstwa zawiesiny komórkowej; Po odwirowaniu komórki groniaste opadną, tworząc osad.
10. Wirować przy 233 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1x kompletnym pożywce Waymouth.
    1. W przypadku bezpośredniego osadzania komórek w kolagenie lub macierzy błony podstawnej, należy ponownie zawiesić w objętości 7 ml na trzustkę. W przypadku zakażenia adenowirusowego lub lentiwirusowego należy ponownie zawiesić w 4 ml na trzustkę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C	Thermo Scientific	SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Inkubator	NUAIRE (NIEWIECH)	NU-5500
Probówki 50 ml	sokół	Numer katalogowy: 352070
Wkładka chłonna, 20" x 24"	Marka rybacka	1420662
Igła do precyzyjnego ślizgu BD 21G x 1/2	Fisher Naukowy	305167	Używaj jako szpilek do preparowania
Zlewka, 600 ml	Marka rybacka	FB-101-600
wirówka	Beckman Coulter	Wirówka Allegra X-15R
Kolagenaza typu I, Clostridium histolyticum	Sigma	Klasa C0130-1G	Stworzyć roztwór o stężeniu 100 mg/ml, rozpuszczając proszek w sterylnej wodzie klasy biologii molekularnej. Podczas rozmrażania jednej podwielokrotności rozcieńczyć do 10 mg/ml, przefiltrować wysterylizować i umieścić 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
deksametazon	Sigma	Zobacz materiał D1756	Sporządzić roztwór o stężeniu 4 mg/ml przez rozpuszczenie proszku w metanolu, porcjowanie i przechowywanie w temperaturze -20 °C.
Etanol, 200 proof	Laboratoria Decon	Numer katalogowy 2701
Surowica bydlęca płodu	Sigma	F0926-100 ml
Kleszcze	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11002-12
Kleszcze	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 91127-12
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej	Fisher Naukowy	SH3048801
Wiadro na lód, prostokątne	Fisher Naukowy	07-210-103
Worki na próbki LAB GUARD (dla myszy po sekcji)	Uchwyt Minigrip	SBL2X69S
Parafilm	Bemis	Zobacz materiał PM992	Określana w manuskrypcie jako "folia parafinowa z tworzywa sztucznego"
Pbs	Fisher Naukowy	SH30028.02
Penicylina-Streptomycyna	ThermoFisher Naukowy	15140122
Końcówki do pipet, 10 μl	USA Naukowe	Nr kat. 1110-3700
Końcówki do pipet, 1000 μl	Olympus Plastics	24-165RL
Końcówki do pipet, 200 μl	USA Naukowe	Lata 1111-1700
Pomoc w pipetowaniu	Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl	Gilson	F123601
Pipety, 10 ml	sokół	357551
Pipety, 25 ml	sokół	357525
Pipety, 5 ml	sokół	357543
Siatka polipropylenowa, 105 μm	Laboratoria widma	146436
Siatka polipropylenowa, 500 μm	Laboratoria widma	146418
nożyczki	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 14568-12
nożyczki	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 14568-13
Wodorowęglan sodu (drobny biały proszek)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP328-500
wodorotlenek sodu	Fisher Naukowy	S318-500
Inhibitor trypsyny sojowej	Gibco (firma Gibco)	17075029
łopatka	Marka rybacka	21-401-10
Filtry Steriflip 50 ml, 0,22 mikrona	Milipory	SCGP00525
Kolagen z ogona szczura typu I	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Medium (proszek)	Sigma	W1625-10X1L
Łódka wagowa, sześciokątna, średnia	Marka rybacka	02-202-101