Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie materiałów, roztworów i trójwymiarowych baz matrycowych
- Pokrój siatki polipropylenowe 500 μm i 105 μm na kwadraty o wymiarach 76 mm na 76 mm. Złóż każdy kwadrat na pół dwa razy, aby utworzyć mniejszy złożony kwadrat. Umieść jeden kwadrat o wielkości 500 μm i jeden kwadrat o oczkach 105 μm w torebce nadającej się do sterylizacji w autoklawie.
- Autoklaw kwadraty z siatki polipropylenowej, a także dwie pary nożyczek i kleszczy.
- Przygotuj 100 ml 10x roztworu Waymouth. Wymieszaj 1 fiolkę (14 g) proszku Waymouth z 50 ml wody dejonizowanej (DI), a po rozpuszczeniu dodaj 30 ml 7,5% (75 g/l) wodorowęglanu sodu. Doprowadź końcową objętość do 100 ml za pomocą wody DI i sterylizuj filtrem.
- Przechowuj 10x pożywki Waymouth w temperaturze 4 °C i użyj do przygotowania żeli kolagenowych i 1x pożywki Waymouth. Gdy wytrąci się tworzą się osady, wyrzuć.
- Przygotuj 50 ml 1x kompletnej pożywki Waymouth na trzustkę, dodając 125 μl 40 mg / ml inhibitora trypsyny sojowej, 12,5 μl 4 mg / ml deksametazonu i 500 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Wysterylizować przez filtrację i zużyć w ciągu 48 godzin.
- Przygotuj 3-wymiarowe podstawy matrycy przy użyciu matrycy kolagenowej lub błony podstawnej (informacje o produkcie znajdują się w tabeli materiałów). Podczas pipetowania bazy umieść płytkę na lodzie, unikaj pęcherzyków i obracaj płytkę natychmiast po pipetowaniu objętości każdej studzienki, aby zapewnić pełne pokrycie.
- Stwórz bazy kolagenowe, mieszając następujące składniki na lodzie w kapturze do hodowli tkankowej: 5,5 ml kolagenu z ogona szczura typu I, 550 μl 10x Waymouth's Pożywki i 366,6 μl 0,34 M NaOH (filtrowany).
UWAGA: Jest to wystarczający roztwór, aby zrobić bazy kolagenowe na jedną płytkę 24-dołkową, 12-dołkową lub 6-dołkową. Jedna płytka wystarcza do izolacji ziarniastej od jednej trzustki.
- Do płytki bazy kolagenowej użyj następujących objętości: 80 μl (szkiełko 8-dołkowe), 200 μL (płytka 24-dołkowa), 400 μL (płytka 12-dołkowa) lub 800 μL (płytka 6-dołkowa).
- W przypadku podstaw matrycy membrany podstawnej należy pipetować matrycę bez żadnych dodatkowych składników. Na każdą studzienkę należy użyć następujących objętości: 50 μl (szkiełko 8-dołkowe), 120 μl (płytka 24-dołkowa), 240 μl (płytka 12-dołkowa) lub 600 μl (płytka 6-dołkowa).
- Pozostawić zasady do zestalenia się przez co najmniej 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5 % CO2 ) przed utworzeniem drugiej warstwy matrycy z osadzonymi komórkami na tych zasadach.
- Przygotowując się do izolacji ziarniastej, pod maską z trzema łódeczkami do ważenia trzymaj jedną zlewkę o pojemności 600 ml, trzy probówki o pojemności 50 ml, autoklawowane nożyczki, autoklawowaną parę kleszczyków i wiadro na lód. Następnie przygotuj 30 ml HBSS z 300 μl 100x penicyliny-streptomycyny, umieszczając 10 ml w każdej z dwóch łódek wagowych i trzymając ostatnie 10 ml w probówce o pojemności 50 ml (do użycia w krokach 1.8.2 i 2.1.4).
- Przygotuj 40 ml HBSS + 5% FBS, 20 ml HBSS + 30% FBS i 5 ml kolagenazy 2 mg / ml w HBSS. Wysterylizuj kolagenazę przez filtrację (pory 0,22 μm) i przechowuj w temperaturze pokojowej. Utrzymuj każdy z roztworów HBSS na lodzie.
- Zmontuj miejsce do sekcji trzustki, którą można wykonać na stole laboratoryjnym.
- Na stole połóż podkładkę chłonną wraz z styropianową pokrywką pokrytą folią. Następnie połóż ręcznik papierowy z 4 szpilkami na wierzchu folii.
- Następujące przedmioty należy przechowywać w zasięgu miejsca spektrum: worek do spalania, jeden zestaw autoklawowanych nożyczek i kleszczy, butelkę z rozpylaczem z 70% etanolem oraz wiadro na lód (z probówką HBSS o pojemności 50 ml zawierającą penicylinę-streptomycynę z kroku 1.6).
- Ustawić wirówkę na 4 °C, a wytrząsarkę na 37 °C.
2. Izolacja komórek groniastych
- Poświęć mysz poprzez indukcję CO2 i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy. Natychmiast wypreparuj trzustkę. Aby wypreparować trzustkę, najpierw przypnij łapy myszy do polistyrenowej pokrywy, ustaw mysz tak, aby ogon był skierowany w stronę badacza i spryskaj brzuch 70% etanolem.
UWAGA: Mysz użyta w reprezentatywnych wynikach była 12-tygodniową nietransgeniczną samicą o pochodzeniu C57BL/6. Wybór myszy jest bardziej szczegółowo omówiony w sekcji dyskusji.
- Używając zestawu autoklawowanych nożyczek i kleszczy, podnieś futro/skórę kleszczami na linii środkowej i użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie przez futro i skórę od otworu cewki moczowej do obszaru przepony/klatki piersiowej.
- Wykonaj dodatkowe nacięcia po lewej i prawej stronie, tak aby futro/skóra została odcięta, aby uzyskać wyraźny widok jamy brzusznej. Następnie wciąć w błonę śluzową otrzewnej (w dół pośrodku oraz w prawo i w lewo) i odciągnąć ją od narządów, tak jak to miało miejsce w przypadku futra/skóry.
- Podnieś jelita kleszczami i połóż je po lewej stronie myszy, tworząc przestrzeń, aby zobaczyć trzustkę, która jest koloru jasnoróżowego i przyczepiona do śledziony, która jest ciemnoczerwonym owalem. Tkanka trzustki wyróżnia się miękką, gąbczastą teksturą. Wytnij trzustkę, która będzie biegła wzdłuż żołądka i przeplatała się z jelitami.
- Oddziel śledzionę od trzustki. Następnie umieść trzustkę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml HBSS z 1x penicyliną-streptomycyną i przynieś ją do okapu z przepływem laminarnym.
nuta: Pozostałe etapy protokołu powinny być wykonane przy użyciu sterylnej techniki w okapie z przepływem laminarnym.
- Wlej trzustkę i HBSS (z penicyliną-streptomycyną) do pustej łodzi wagowej i za pomocą kleszczy umyj trzustkę, obracając ją. Następnie przenieś trzustkę z kleszczami do drugiej łodzi ważącej zawierającej HBSS (z penicyliną-streptomycyną). Ponownie umyj trzustkę, obracając.
- Przenieść trzustkę do trzeciej łodzi wagowej zawierającej HBSS (z penicyliną-streptomycyną) i rozpocząć cięcie trzustki na małe kawałki o średnicy 5 mm lub mniejszej. Następnie wlej kawałki trzustki i HBSS do pustej probówki o pojemności 50 ml.
- Aby to zrobić, użyj kleszczy, aby przesunąć kawałki trzustki do płynu podczas przechylania łodzi wagowej. Wlej, gdy wszystkie kawałki nie są już przymocowane do łodzi wagowej. Zebrać wszystkie pozostałe kawałki za pomocą kleszczyków i umyć kleszcze w 50 ml probówce zawierającej trzustkę w HBSS z penicyliną-streptomycyną.
- Wirować przy 931 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć HBSS (i wszelki tłuszcz, który się unosi), pipetując go pipetą o pojemności 5 ml.
- Dodaj 5 ml kolagenazy (rozcieńczonej w HBSS w kroku 1.7) do trzustki. Owijając probówkę o pojemności 50 ml plastikową folią parafinową, należy upewnić się, że jest szczelnie zamknięta, a następnie umieścić ją w inkubatorze, wstrząsając z prędkością 220 obr./min przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Czas trawienia kolagenazy może się różnić, jak zauważono w dyskusji. Pod koniec inkubacji nie powinny pozostać żadne duże kawałki tkanki.
- Aby zatrzymać dysocjację, umieść rurkę zawierającą trzustkę na lodzie i dodaj 5 ml zimnego HBSS + 5% FBS. Wirować przy 931 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie odpipetować supernatant za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
- Zawiesić w 10 ml HBSS + 5% FBS i odwirować przy 931 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odpipetować supernatant za pomocą pipety o pojemności 5 ml i powtórzyć ten krok z kolejnymi 10 ml HBSS + 5% FBS.
- Zawiesić ponownie w 5 ml HBSS + 5% FBS i za pomocą P1000 przenieść 1 ml na raz przez siatkę 500 μm do probówki o pojemności 50 ml. Dodaj dodatkowe 5 ml HBSS + 5% FBS przez siatkę z P1000, aby przemyć pozostałe komórki trzustki przez siatkę.
- Zawiesinę komórek z siatki 500 μm przepuścić przez siatkę 105 μm, pipetując po 1 ml za pomocą P1000. Następnie delikatnie odpipetować zawiesinę komórkową do probówki zawierającej HBSS + 30% FBS. Na górze utworzy się warstwa zawiesiny komórkowej; Po odwirowaniu komórki groniaste opadną, tworząc osad.
- Wirować przy 233 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1x kompletnym pożywce Waymouth.
- W przypadku bezpośredniego osadzania komórek w kolagenie lub macierzy błony podstawnej, należy ponownie zawiesić w objętości 7 ml na trzustkę. W przypadku zakażenia adenowirusowego lub lentiwirusowego należy ponownie zawiesić w 4 ml na trzustkę.
3. Infekcja wirusowa
- Ponieważ jedna trzustka wystarcza do dwóch infekcji wirusowych (kontrolnej i eksperymentalnej, np. null i cre), należy podzielić zawiesinę komórkową między pokrywki dwóch płytek o średnicy 35 mm. Użycie pokrywy płytek pozwala na infekcję w zawiesinie, a tym samym łatwe przemieszczanie się na końcowe podłoże w późniejszym czasie.
- Podczas pracy z wirusem namocz wszystkie zużyte końcówki pipet w 10% wybielaczu przez co najmniej 15 minut.
nuta: Wykorzystanie płytek o średnicy 35 mm i objętości 4 ml działa dobrze w przypadku komórek nietransgenicznych myszy w wieku od 8 do 16 tygodni. Rozmiar i objętość płytki może być konieczne dostosowanie dla zwierząt z mniejszą lub większą trzustką.
- W przypadku zakażenia adenowirusowego dodać wirusa (o mianie co najmniej 107 TU/ml) w rozcieńczeniu 1:1,000 do pokrywki każdej płytki i zawirować (ryc. 1, adenowirus GFP). Umieścić płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) i mieszać co 15 minut przez 1 godzinę. Kontynuuj inkubację przez dodatkowe 2 godziny, a następnie przystąp do osadzania komórek w kolagenie lub macierzy błony podstawnej.
- Po zakończeniu pracy wirusowej w okapie namocz wszystkie składniki w okapie z 10% wybielaczem przez co najmniej 15 minut, a następnie dokładnie wyczyść wybielacz za pomocą 70% etanolu.
4. Osadzenie komórek w matrycy kolagenu lub błony podstawnej
- Przygotuj żel kolagenowy na lodzie, łącząc 7 ml kolagenu ze szczurzego ogona typu I (3,3 mg / ml), 700 μl 10x pożywki Waymouth i 466,6 μl 0,34 M NaOH.
- Biorąc równe objętości żelu kolagenowego i zawiesiny komórkowej, delikatnie wymieszaj. Jeśli dodajesz bodziec lub inhibitor, połącz go z zawiesiną komórek kolagenowych. Płytka po jednej studzience na raz (płytki z kroku 1.5.3); Trzymając płytkę na lodzie, obracaj, aby równomiernie rozprowadzić warstwę komórek kolagenowych.
- Do każdego dołka odpipetuj następujące objętości zawiesiny komórek kolagenowych: 200 μl (szkiełko 8-dołkowe), 500 μl (płytka 24-dołkowa), 1000 μl (płytka 12-dołkowa) lub 2000 μl (płytka 6-dołkowa). Należy zauważyć, że ADM jest indukowany przez stymulację TGF-α (50 ng / ml) na rysunku 1.
- W celu osadzenia komórek w macierzy błony podstawnej należy zmieszać jednoczęściową matrycę błony podstawnej z dwuczęściową zawiesiną komórkową. Podobnie jak w przypadku kolagenu, zawiesinę komórek matrycy, a także płytkę należy trzymać na lodzie. Pipetować pojedynczo, używając tych samych objętości, co w ppkt 4.2.1 i mieszać w celu równomiernego rozprowadzenia.
- Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2) na 30 minut w celu zestalenia, a następnie dodaj 1x kompletną pożywkę Waymouth z dowolnym bodźcem lub inhibitorem (Rysunek 1 wykorzystuje TGF-α przy 50 ng / ml). Zmieniaj pożywkę (z bodźcem lub inhibitorem) następnego dnia, a następnie co drugi dzień. W zależności od bodźca, ADM można zaobserwować między 3. a 5. dniem.
