Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
Potrzebne narzędzia chirurgiczne są pokazane na rysunku 1, a schemat zabiegu jest pokazany na rysunku 2.
1. Rozwiązania
- Przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), dodając 100 ml 10X HBSS (z bulionu) do 900 ml wody destylowanej, aby uzyskać 1 l HBSS (1X).
- Przygotować roztwór STOP (musi być świeży i powinien być zużyty w ciągu 1 godziny), dodając 50 ml 100X płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 450 ml lodowatego 1X HBSS; daje to 500 ml roztworu STOP. Roztwór STOP należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotować roztwór kolagenazy P (musi być świeży w ciągu 1 godziny od użycia), dodając 1 mg/ml kolagenazy P do lodowatego 1X HBSS; użyć 6 ml / mysz.
- Dodać 0,05% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do roztworu kolagenazy P (dostarcza to składniki odżywcze do izolowanych wysp trzustkowych). Na przykład, użyj 3 mg BSA w 6 ml roztworu kolagenazy P. Trzymaj na lodzie.
- Oblicz i przygotuj ilość kolagenazy P potrzebną dla wszystkich myszy w jednej probówce o pojemności 50 ml.
- Przygotuj kompletną pożywkę RPMI 1640, dodając 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, suplementu komórkowego INS-1 (10 mM HEPES, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu i 0,05 mM 2-merkaptoetanolu) do 500 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 5,5 mM glukozy, która ma być użyta do nocnej hodowli i inkubacji.
2. Przygotowanie
- Napełnij trzy probówki o pojemności 50 ml 25 ml roztworu hamującego RNazę, 70% etanolu lub destylowanegoH2O. Roztwory te będą wykorzystywane do czyszczenia narzędzi chirurgicznych przed i w trakcie zabiegu.
- Namocz końcówki narzędzi w roztworze hamującym RNazę na 30 minut przed rozpoczęciem protokołu; eliminuje to wszelkie potencjalne RNazy na narzędziach.
- Wstępnie przycięte wkładki chłonne o wymiarach 6 cali x 6 cali do użytku podczas operacji.
- Przygotować 1X roztwór HBSS wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować roztwór STOP przed zabiegiem. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Bezpośrednio przed zabiegiem należy przygotować roztwór kolagenazy P i przechowywać na lodzie.
nuta: Należy go zużyć w ciągu 2 godzin od przygotowania.
- Oznacz probówki o pojemności 50 ml do trawienia i oczyszczania; przygotuj 2 probówki dla każdej myszy, jedną do trawienia, a drugą do oczyszczania wysp trzustkowych. Upewnij się, że identyfikator zwierzęcia znajduje się na obu probówkach.
- Dodać 3 ml roztworu kolagenazy P do pierwszej probówki o objętości 50 ml. Pozostałe 3 ml kolagenazy P zostaną wstrzyknięte.
- Pobrać pozostałe 3 ml roztworu kolagenazy do strzykawki o pojemności 3 ml z igłą o sile 30 G 1/2 cala. Umieścić strzykawkę na lodzie.
3. Procedura
- Wyjmij wszystkie narzędzia z roztworu hamującego RNazę, a następnie zanurz je najpierw w probówce z 70% etanolem, następnie w probówce zawierającej destylowany H2O, a następnie wysusz na powietrzu na czystym ręczniku papierowym.
- Umieść mysz w komorze zawierającej 0,5 ml izofluranu, aż mysz zostanie głęboko znieczulona.
- Wyjmij mysz z komory i sprawdź stan znieczulenia, ściskając opuszkę stopy kleszczami. Głębokie znieczulenie opiera się na obserwacji, że oddech staje się coraz wolniejszy, a mysz nie reaguje na szczypanie stóp. Po potwierdzeniu, że mysz jest głęboko znieczulona, należy poddać ją eutanazji ze zwichnięciem szyjki macicy, a następnie umieścić mysz na podkładce chłonnej.
- Umieść znieczuloną mysz na brzuchu, wywierając nacisk na szyję i zwichając kręgosłup od mózgu, ciągnąc za ogon.
- Przyklej kończyny myszy w pozycji leżącej do wkładki chłonnej, spryskaj ciało 70% etanolem i zetrzyj nadmiar etanolu.
- Do wykonania nacięć użyj kleszczyków ze szkła nakrywkowego i zakrzywionych nożyczek chirurgicznych. Najpierw wykonaj poziome nacięcie na skórze okolicy brzucha (~3 cm), pociągnij skórę szeroko, aby odsłonić ścianę brzucha. Następnie wykonaj pionowe nacięcie (~3–4 cm) na otrzewnej brzusznej, aby w pełni odsłonić trzustkę w jamie brzusznej (ryc. 3).
- Popchnij płaty wątroby wyżej, aby odsłonić przewód żółciowy, pojawi się on jako bladoróżowa rurka (ryc. 3).
- Ostrożnie przesuń jelita z prawego odcinka lędźwiowego/biodrowego jamy brzusznej w prawo, odsłaniając przewód żółciowy i tętnicę wątrobową (ryc. 3).
- Ostrożnie zacisnąć wspólny przewód żółciowy za pomocą mikroserrefinów Schwartza (ryc. 1) jak najbliżej wątroby.
- Zidentyfikuj bańkę Vatera, która znajduje się na brodawce dwunastnicy, utworzonej przez połączenie przewodu trzustkowego i wspólnego przewodu żółciowego. Bańka Vatera wydaje się spuchnięta, gdy patrzy się na nią pod mikroskopem preparacyjnym, który jest punktem wejścia do wspólnego przewodu żółciowego (ryc. 4).
nuta: Regulacja intensywności/kąta padania światła mikroskopu preparacyjnego może ułatwić jego zlokalizowanie.
- Wprowadzić strzykawkę z 3 ml roztworu kolagenazy P do bańki Vatera. Wbić igłę do przewodu na około 1/4 długości wspólnego przewodu żółciowego (bańka prowadzi do kanału), jak pokazano na rysunku 5.
- Gdy igła znajdzie się w bańce, upewnij się, że orientacja igły jest taka, aby była równoległa do przewodu.
- Ustabilizuj igłę, zaciskając ją mikrokleszkami Adson, aby zapobiec jej przebiciu kanału (Rysunek 5).
- Powoli i równomiernie wstrzyknąć 3 ml roztworu kolagenazy P ze strzykawki do wspólnego przewodu żółciowego (wystarczająco dużo, aby poczuć opór), jak pokazano na rysunku 6. Celem jest wytworzenie ciśnienia zwrotnego, aby zmusić kolagenazę do wejścia do przewodu trzustkowego. Wstrzyknięcie uważa się za udane, jeśli głowa, szyja, tułów i ogon trzustki są w pełni napompowane.
nuta: Wydajność wysp trzustkowych będzie niska, jeśli trzustka nie jest w pełni napompowana lub obszar śledziony nie jest w pełni napompowany. Obszar śledziony zawiera największą liczbę wysepek6. Napompowanie można potwierdzić poprzez pojawienie się otwartych przestrzeni między tkanką trzustki, które są wypełnione roztworem.
- Ostrożnie wypreparuj napompowaną trzustkę i umieść ją w probówce do wytrawiania o pojemności 50 ml zawierającej 3 ml lodowatego roztworu kolagenazy P.
- Usuń trzustkę za pomocą 2 kleszczy (zakrzywionych i Micro Adson; Patrz rycina 1): (zaczynając od śledziony, odciągnij trzustkę od śledziony i kontynuuj usuwanie z żołądka i wzdłuż dwunastnicy.
nuta: Nie są wymagane żadne nacięcia.
- Siekaj trzustkę przez 3-5 s w probówce wytrawiającej z 3 ml lodowatego roztworu kolagenazy P za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych (ryc. 7A).
- Przymocuj probówkę do stojaka w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i potrząsaj z prędkością 100–120 obr./min przez około 12–13 minut.
- Po inkubacji delikatnie potrząśnij ręcznie probówkami, aby rozbić tkankę, aż roztwór do trawienia kolagenazy P stanie się jednorodny (ryc. 7B). Jednorodność potwierdza przypominający piasek wygląd drobnych cząstek trzustki. Zwykle wystarcza około 30 sekund delikatnego uścisku dłoni. Trzymaj probówkę do światła, aby sprawdzić, czy tkanka jest dobrze zhomogenizowana; W razie potrzeby wstrząsaj przez kolejne ~15 s.
- Po strawieniu natychmiast umieść probówki na lodzie i dodaj 40 ml lodowatego roztworu STOP, aby zakończyć trawienie enzymatyczne.
nuta: W tym momencie rurki wytrawiające można pozostawić na lodzie do 2 godzin, jeśli pracujesz na wielu myszach.
- Odwirować probówkę w wirówce z odchylanym wiadrem o sile 300 x g przez 30 s (temperatura wirówki jest elastyczna).
nuta: Użyć wirówki z odchylanym wiadrem tak, aby osad tkankowy powstał na dnie probówki o pojemności 50 ml, a nie na ściance probówki; Ma to kluczowe znaczenie dla lepszego plonowania wysepek.
- Zdekantować i powtórzyć wirowanie z roztworem STOP jeszcze 2 razy, dekantując roztwór po każdym wirowaniu. Do każdego kolejnego prania należy stosować 20 ml roztworu STOP.
- Przed każdym wirowaniem należy rozbić osad, delikatnie potrząsając osadem tkankowym w probówce o pojemności 50 ml w roztworze STOP o pojemności 20 ml.
- Ponownie zawiesić osad tkankowy w 40 ml lodowatego HBSS i odwirować przy 300 x g przez 30 s.
- Zdekantować i powtórzyć wirowanie za pomocą wirówki z odchylanym wiadrem z roztworem HBSS jeszcze dwa razy, dekantując roztwór po każdym wirowaniu. Użyj 20 ml HBSS do każdego prania.
- Przed każdym wirowaniem należy rozbić osad, aby oderwać go od dna probówki, delikatnie potrząsając probówką zawierającą 20 ml roztworu HBSS.
- Po ostatnim odwirowaniu usuń wszystkie HBSS.
- Następnie dodać 5 ml gradientu gęstości w temperaturze pokojowej do probówki o pojemności 50 ml zawierającej osad. Krótko mieszać na niskich obrotach, aż do homogenizacji.
- Dodać kolejne 5 ml gradientu gęstości temperatury pokojowej do probówki o pojemności 50 ml. Nie mieszać/mieszać.
nuta: Bardzo ważne jest, aby pozostać stabilnym i nieruchomym, aby umożliwić tworzenie się lepszego nachylenia bez zakłóceń.
- Odpipetować 10 ml buforu HBSS o temperaturze pokojowej do probówki (zawierającej gradient gęstości), kropla po kropli, delikatnie i powoli, aby umożliwić utworzenie gradientu. Użyj pistoletu do pipet z pipetą o pojemności 10 ml, aby dodać HBSS kroplami.
- Za pomocą wirówki z obrotowym wiadrem wiruj probówki o masie 1700 x g przez 15 minut. Upewnij się, że prędkość zarówno przyspieszania/zwalniania, jak i zwalniania została zmieniona na najniższe, aby utrzymać nachylenie (Rysunek 7C).
- Po wirowaniu ostrożnie wyjmij rurki, nie naruszając gradientu. Za pomocą pistoletu do pipet wstępnie zwilżonego zimnym HBSS (pipeta HBSS w górę i w dół) odpipetuj warstwę wysepek (5–10 ml) utworzoną między gradientem gęstości a HBSS do nowej probówki do pobierania wysepek o pojemności 50 ml.
nuta: Pomocne jest zwilżenie pipety zimnym HBSS przed pipetowaniem wysepek, aby zapobiec przywieraniu wysp trzustkowych do wewnętrznych ścianek pipety.
- W przypadku, gdy separacja jest niekompletna, wysepki będą widoczne w warstwie gradientu gęstości, odpipetuj całe 10 ml gradientu gęstości (dolna warstwa) wraz z warstwą wysepek utworzoną na granicy faz (tylko po to, aby pozostawić około 8–10 ml górnej warstwy HBSS z tyłu).
nuta: Zbieranie zarówno warstwy wysepek, jak i warstwy gradientu gęstości (warstwa dolna) może spowodować zebranie gruzu, co może wydłużyć czas wybierania wysepek, ale żadne inne kroki nie zostaną zmienione. Zbieranie obu tych warstw nie jest konieczne, gdy warstwa wysepek jest dobrze uformowana.
- Dodać 20 ml lodowatego HBSS do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej wysepki, a następnie odwirować przy 350 x g przez 3 minuty w wirówce z odchylanym wiadrem.
- Po odwirowaniu ostrożnie odpipetować (nie dekantować) supernatant (pozostawić ~3 ml na dnie) bez naruszania osadu zawierającego wysepki na dnie. Odrzucić supernatant.
- Powtórz mycie i odwirowywanie co najmniej 3 razy. Za każdym razem dodawaj 20 ml HBSS i pamiętaj, aby zawiesić granulkę przed każdym wirowaniem.
- Przed użyciem podgrzej kompletną butelkę z mediami RPMI-1640 w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Po ostatnim odwirowaniu usunąć cały HBSS i dodać 4 ml wcześniej przygotowanej kompletnej pożywki RPMI-1640 (zawierającej FBS, dodatek komórkowy INS-1 i penicylinę/streptomycynę) do osadu.
- Usuń osad, delikatnie obracając probówkę i natychmiast wlej pożywkę RPMI-1640 do szalki Petriego o średnicy 100 mm. Dodaj kolejne 5 ml pożywki RPMI-1640 do probówki i delikatnie ją zamieszaj, aby zmyć wszelkie pozostałe wysepki, a następnie wlej pożywkę do tej samej szalki Petriego.
- Pod mikroskopem preparacyjnym pobrać zdrowe wysepki z szalki Petriego za pomocą pipety o pojemności 20 μl i umieścić je na nowej szalce Petriego zawierającej 10 ml kompletnej pożywki RPMI 1640. Oglądane pod mikroskopem sekcyjnym wysepki powinny mieć kulisty/podłużny i złotobrązowy kolor z gładką powierzchnią w porównaniu ze stosunkowo przezroczystą, delikatną tkanką zewnątrzwydzielniczą.
nuta: Powiększenie mikroskopu preparacyjnego jest zwykle ustawione na 12,5–16x. Wydajność wysepek będzie się różnić w zależności od różnych czynników, w tym odmiany, wieku i płci myszy. Ten protokół zwykle daje 250-350 zdrowych wysepek od zdrowej myszy C57BL/6J w wieku 4-10 miesięcy.
- Inkubować wyspy trzustkowe w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% naparemCO2 i 95% nawilżonym powietrzem przez noc do eksperymentów następnego dnia lub zamrozić wysepki do pożądanej analizy w późniejszym czasie.
- Po zamrożeniu wysp trzustkowych nie można ich używać do oznaczania wydzielania, a jedynie do oznaczania ilościowego RNA lub białka. Aby zebrać komórki do zamrożenia, umieścić je w buforze HBSS, zebrać wszystkie wysepki w 200–500 μl buforu, przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml, odwirować 350 x g przez 1–2 min, usunąć supernatant pozostawiając nie więcej niż 30–40 μl roztworu, umieścić w temperaturze -20 °C do krótkotrwałego przechowywania (kilka dni) lub -80 °C do długotrwałego przechowywania.
