Barwienie immunofluorescencyjne sferoid: technika analizy sferoid pod kątem ekspresji wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej ekspresji antygenu

Streszczenie

Źródło: Cavaco, A. C. M. et al. Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje technikę barwienia immunofluorescencyjnego sferoidów, aby zrozumieć różnicowanie fibroblastów lub CAF. Protokół ten pomaga wykrywać ekspresję antygenów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, w tym odkładanie się białek ECM w sferoidach.

Protokół

1. Barwienie immunofluorescencyjne sferoidów

1. Po około 24 godzinach zebrać sferoidy do jednej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml na warunki eksperymentalne lub na białko, które ma być analizowane. Na przykład umieść sferoidy iNF stymulowanych TGF-β1 w probówce innej niż kontrolne iNF, które nie były poddawane obróbce. Aby uniknąć pęknięcia sferoid z powodu zbyt dużych sił ścinających, odetnij koniec końcówki pipety, aby powiększyć otwór. Umieścić co najmniej 5-10 sferoid w jednej probówce reakcyjnej, aby umożliwić powtórzenia i uwzględnić możliwe straty podczas etapów mycia.
2. Odwirować sferoidy za pomocą wirówki stołowej przez około 30-60 s przy 1,000 x g. Ostrożnie usunąć supernatant zawierający metylocelulozę przez pipetowanie, nie naruszając granulowanych sferoidów.
3. Umyć 50 μL 1x PBS. Powtórzyć etap wirowania i ostrożnie usunąć PBS przez pipetowanie, jak opisano w ppkt 1.2.
4. W zależności od białka, które ma być barwione, utrwalić 50 μl 4% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej (dla αSMA, NG2 i integryny α3β1) lub z 50 μl metanolu przez 10 minut w temperaturze -20 °C (dla podjednostek lamininy-332).
5. Powtórz krok prania, jak wyjaśniono w krokach 1.2-1.3.
6. Przepuszczalność komórek z 0,1% Triton-X w PBS przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
7. Powtórz krok prania, jak wyjaśniono w krokach 1.2-1.3 trzy razy.
8. Inkubować sferoidy w PBS zawierającym 5% FBS i 2% BSA, przez 1 godzinę w RT w celu zablokowania niespecyficznych miejsc interakcji białek.
9. Inkubować sferoidy z 30 μl przeciwciał pierwszorzędowych w PBS, 2,5% FBS i 1% BSA w temperaturze 4 °C przez noc. Zastosowano następujące przeciwciała pierwszorzędowe: anty-αSMA Cy-3 sprzężone i anty-NG2 w stężeniu 5 μg/ml; BM2 anty-laminina α3, 6F12 anty-laminina β3 i anty-laminina γ2 20 μg/ml.
10. Powtórz krok prania, jak wyjaśniono w krokach 1.2-1.3 trzy razy.
11. Inkubować sferoidy z 30 μl przeciwciał drugorzędowych w PBS, 2,5% FBS i 1% BSA w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Następujące stosowane przeciwciała drugorzędowe to: Alexa 488 anty-królicze i anty-mysie (5 μg/ml).
12. Powtórz krok prania, jak wyjaśniono w krokach 1.2-1.3 trzy razy.
13. Inkubować komórki z 30 μl roztworu barwiącego DAPI przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
14. Powtórz krok prania, jak wyjaśniono w krokach 1.2-1.3.
15. Umieścić sferoidy na szkiełku podstawowym w kropli PBS, używając szklanej pipety Pasteura.
16. Zobrazuj sferoidy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w laserowym mikroskopie skaningowym przy użyciu powiększenia 10x. Weź różny przekrój optyczny sferoidy w różnych płaszczyznach optycznych stosu z (15-20 płaszczyzn stosu). Aby ustalić ustawienia lasera w mikroskopie, należy użyć sferoidy złożonej z komórek ujemnych dla badanego antygenu lub sferoidy wybarwionej tylko przeciwciałem drugorzędowym. Użyj ponownie tych samych ustawień dla wszystkich próbek, które zostaną porównane.
17. Analizuj obrazy mikroskopowe za pomocą oprogramowania ImageJ, jak opublikowano wcześniej. Kroki są podsumowane na rysunku 1. Jako tło określ zintegrowaną gęstość sygnału bezkomórkowego obszaru zainteresowania (ROI). Oblicz całkowitą skorygowaną fluorescencję komórek (TCCF) jako:
    TCCF = zintegrowana gęstość sygnału - (obszar wybranej sferoidy x średnia fluorescencja tła)
18. Określ całkowitą skorygowaną fluorescencję (TCF) sferoid, gdy TCCF znormalizował się do obszaru sferoidy i liczby stosów.
    TCF = TCCF sferoidy / (powierzchnia sferoid x liczba stosów)

Wyniki

Rysunek 1. Sekwencyjne etapy ilościowego oznaczania barwienia immunofluorescencyjnego białka będącego przedmiotem zainteresowania w sferoidach przy użyciu ImageJ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dichlorowodorek 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI)	SIGMA-ALDRICH	Zobacz materiał D9542-10
6F12 podjednostka anty-Laminina β3 Mysz (monoklonalna)			domowej roboty
Frakcja albuminy V - BSA	Zastosowanie	A1391 (wersja angielska
Alexa fluor 488 Koza (poliklonalna) anty-Myszy	Invitrogen	Nr kat. A11029
Alexa fluor 488 Koza (poliklonalna) Królik	Invitrogen	A11034
Podjednostka anty-laminina γ2 Mysz (monoklonalna)	Santa Cruz	SC-28330
Wirówka stołowa	Fisher Naukowy	50-589-620	kiełek
BM2 podjednostka anty-laminina α3 Mysz (monoklonalna)			Uprzejme udostępnione przez prof. Patricię Rousselle, CNRS, Lyon
Probówki wirówkowe 50 ml	Corning	Numer katalogowy: 430290
Mikroskop konfokalny	Zeiss
DMEM (wysoka zawartość glukozy 4,5 g/l)	Lonza	BE12-604F
Ludzkie pierwotne fibroblasty trzustki	PELOBiotech	PB-H-6201
Penicylina/streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122
Szkiełka mikroskopowe	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Paraformaldehyd	Riedel-de Haën	Numer katalogowy: 16005
Silnik TritonX-100	SIGMA-ALDRICH	Zobacz materiał X100RS