Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami i komisję rewizyjną Jove Veterinary Review Board.
1. IRE guzów SQ
- Przygotuj wymagane materiały: elektroporator fali prostokątnej, nożny wyłącznik bezpieczeństwa, elektrody (igła kontra pęseta) i adaptery. W pobliżu trzymaj sterylne szwy (niewchłanialne 4-0), waciki nasączone alkoholem, maszynkę do strzyżenia włosów, krem do depilacji, lubrykant do oczu, gazę bawełnianą, buprenorfinę i środki znieczulające.
- Wysterylizuj pęsetę lub elektrody igieł za pomocą sterylizacji gazowej. Autoklawowanie nie jest zalecane. Użyj sterylizatora z kulkami szklanymi, aby wysterylizować elektrody między zwierzętami.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby skutecznie wywołać znieczulenie u myszy, gdy implant nowotworowy SQ osiągnie średnicę 5 mm. Krótko podawać myszowi biorcy 0,05 - 1 mg / kg buprenorfiny przeciwbólowej SQ, 30 minut przed zabiegiem. Następnie znieczulij myszy biorcę 2 - 3% izofluranem w tlenie (2 l/min) za pomocą precyzyjnego waporyzatora (lub innych środków znieczulających). Trzymaj myszy na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C przez cały czas trwania zabiegu. Nałóż lubrykant na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Przetestuj głębokość znieczulenia przez brak odruchu zaskoczenia na początku i potwierdź znieczulenie płaszczyzną chirurgiczną przez brak odruchu pedałowania do delikatnego uszczypnięcia palca. Utrzymuj znieczulenie podczas całego zabiegu chirurgicznego.
- Umieść znieczuloną mysz na boku, aby uzyskać dostęp do guza SQ na boku. Usuń włosy za pomocą maszynki do strzyżenia i oczyść skórę za pomocą wacika nasączonego alkoholem.
- W przypadku guzów SQ należy użyć elektrod 2-igłowych. Podnieś skórę bezpośrednio pod miejscem guza za pomocą kleszczy i wprowadź elektrody przez skórę równolegle do ciała, upewniając się, że nie przenikają do jamy otrzewnej. Po przejściu przez skórę umieść elektrody w taki sposób, aby obejmowały guz.
- Zaprogramuj elektroporator tak, aby dostarczał impulsy 100 μs z częstotliwością 1 Hz przy 1 500 V/cm, co daje łącznie 150 impulsów. Dostarczaj impulsy za pomocą pedału nożnego. Oddziel każdy zestaw 10 impulsów przez 10 s, aby umożliwić rozproszenie ciepła i potwierdzić prawidłowe położenie elektrod.
nuta: Bez użycia środków paraliżujących myszy będą doświadczać skurczów mięśni z IRE, które mogą powodować przemieszczenie elektrod, chyba że zostaną ręcznie zabezpieczone.
- Wyjmij elektrody po całkowitym dozowaniu, które nie powinno przekraczać 200 s. Zapisz rzeczywiste dostarczone napięcie, które jest wyświetlane na elektroporatorze. Pozwól myszom dojść do siebie po IRE w klatce domowej ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody. Umieść klatkę na poduszce grzewczej, aby ułatwić regenerację. Monitoruj parametry życiowe, takie jak oddychanie, perfuzja itp., podczas procesu rekonwalescencji. Potwierdź oznaki odruchu prostowania, gdy mysz wyzdrowieje, a następnie przywróć klatkę do zwykłej obudowy. Buprenorfinę podawać w dawce 0,05 - 0,1 mg/kg 8 - 12 godzin po zabiegu i co 8 - 12 godzin po zabiegu w razie potrzeby w przypadku objawów bólu.
2. IRE guzów ortotopowych
UWAGA: IRE guzów ortotopowych wymaga drugiej operacji przeżycia na tej samej myszy, co wymaga specjalnej zgody lokalnego IACUC przed rozpoczęciem.
- Przygotuj wymagane materiały: autoklaw narzędzi chirurgicznych, takich jak nożyczki, skalpele, wkrętaki do igieł, spiczaste kleszcze i kleszcze z płaską końcówką. Trzymaj również w pobliżu: sterylne szwy (wchłanialne 6-0 i niewchłanialne 4-0), waciki nasączone alkoholem, maszynki do strzyżenia włosów, krem do depilacji, lubrykant do oczu, gaza bawełniana, 10% roztwór jodu powidonu, serwety chirurgiczne, poduszki grzewcze, elektroporator fali prostokątnej, nożny wyłącznik bezpieczeństwa, elektrody i ich adaptery, buprenorfina i środki znieczulające.
- Oceń myszy pod kątem ortotopowego wzrostu guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo. Śledź wzrost guza poprzez obrazowanie, zaczynając od 4 dnia po implantacji ortotopowej i wykonuj obrazowanie dwa razy w tygodniu. W dniu obrazowania należy podać (wstrzyknięcie dootrzewnowe) 30 mg/kg D-lucyferyny znieczulonej (2 - 3% izofluranu w tlenie (2 l/min)) myszy biorcy 10 minut przed obrazowaniem. Obraz aktywności lucyferazy przy użyciu ustawienia luminescencji bez żadnych filtrów emisyjnych przez co najmniej 5 s ekspozycji w obrazie luminescencyjnym z podgrzewanym stopniem wolnym od autofluorescencji i przy jednoczesnym zachowaniu znieczulenia dla myszy.
nuta: Guzy ortotopowe są idealne do leczenia IRE od 8 do 10 dni po implantacji, kiedy guzy są wyraźnie widoczne i nadal ograniczone do trzustki, jak widać na obrazach luminescencyjnych lucyferazy
- Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zlokalizować wszczepiony guz. Krótko podawać myszowi biorcę 0,05 - 1 mg/kg buprenorfiny przeciwbólowej SQ, 30 minut przed zabiegiem. Znieczulić myszy biorcę 2 - 3% izofluranem w tlenie (2 l/min) za pomocą precyzyjnego waporyzatora (lub innych środków znieczulających). Trzymaj myszy na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C przez cały czas trwania zabiegu. Nałóż lubrykant na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Przetestuj głębokość znieczulenia przez brak odruchu zaskoczenia na początku i potwierdź znieczulenie płaszczyzną chirurgiczną przez brak odruchu pedałowania do delikatnego uszczypnięcia palca. Utrzymuj znieczulenie podczas całego zabiegu chirurgicznego. Połóż mysz na plecach i delikatnie obróć ją na prawą stronę, tak aby lewa strona brzucha była odsłonięta. Usuń włosy na brzuchu myszy za pomocą kremu do depilacji i wyczyść gazą, aby upewnić się, że żadne wolne włosy nie dostają się do brzucha po nacięciu. Przygotuj lewą jamę brzuszną do zabiegu za pomocą 3 cykli 10% jodowidonu, a następnie chusteczek nasączonych alkoholem w celu dezynfekcji skóry. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj 1,5-centymetrowe poprzeczne lub ukośne nacięcie w skórze, 1 cm na lewo od linii środkowej, poniżej klatki piersiowej, lekko przyśrodkowo do śledziony. Następnie przedłuż nacięcie przez mięśnie brzucha, odzwierciedlając leżące nad nim powierzchowne nacięcie. Zlokalizuj śledzionę za pomocą kleszczy z płaską końcówką i delikatnie uzewnętrznij ją z jamy brzusznej. Cofnij śledzionę za pomocą sterylnego bawełnianego aplikatora i znajdź ogon trzustki przymocowany do dolnej części śledziony. Za pomocą kleszczy z płaską końcówką cofnij ogon trzustki na boki. Jeśli guz nie jest łatwy do zlokalizowania, użyj kleszczy z nosem, aby delikatnie przesunąć żołądek i śledzionę, aby zidentyfikować guz.
- Uzewnętrznij guz za pomocą kleszczy z nosem i mocno uchwyć guz za pomocą platynowych elektrod pęsety. Dostarczaj impulsy elektroporacyjne zgodnie z programowaniem w kroku 1.7 za pomocą elektroporatora prostokątnego w zestawach po 10 impulsów sterowanych przełącznikiem nożnym.
- Utrzymuj guz uzewnętrzniony przez co najmniej 60 s po IRE, aby monitorować wszelkie oznaki krwotoku. Włóż guz z powrotem do jamy brzusznej i zamknij nacięcie zgodnie z opisem. Krótko mówiąc, zamknij mięśnie brzucha za pomocą wchłanialnego szwu 6-0 z ciągłym lub przerywanym szwem i zamknij leżącą nad nim skórę za pomocą niewchłanialnego szwu przerywanego od 3-0 do 6-0. W tym momencie należy przerwać znieczulenie. Pozwól myszy na odzyskanie sprawności zgodnie z opisem w punkcie 1.7. Monitoruj mysz do momentu jej odzyskania.
- Monitoruj wpływ IRE na wzrost guza za pomocą obrazowania lucyferazy in vivo, jak opisano w kroku 2.2.
