Magnetycznie biodrukowane kokultury sferoidalne 3D: metoda kohodowli komórek rakowych i fibroblastów

Streszczenie

Źródło: Noel P. et al.Przygotowanie i test metaboliczny 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film wyjaśnia magnetyczny biodruk 3D hodowanych komórek raka trzustki i fibroblastów. Komórki raka trzustki i aktywowane komórki fibroblastów trzustki są hodowane i magnetyzowane przy użyciu biokompatybilnego zestawu nanocząstek, w celu wytworzenia sferoid pod wpływem sił magnetycznych.

Protokół

1.Hodowla sferoid 3D raka trzustki za pomocą biodruku magnetycznego

1. Stosując standardową technikę aseptycznej hodowli tkankowej, hoduj interesujące komórki w kolbie T75 do zbiegu 70-80% w odpowiednich pożywkach wzrostowych.
   nuta: Zazwyczaj pobiera się 5-7 × 10⁶ komórek z 70-80% zlewającej się kolby T75. W tym badaniu wykorzystano dwa różne typy komórek - Patu8902 (komórki nowotworowe trzustki) i komórki PS1 (aktywowane komórki gwiaździste trzustki). Obie linie komórkowe hodowano w pożywce Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1× penicyliny-streptomycyny (p / s).
2. Umyj komórki raz 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco.
3. Oderwij komórki od plastikowej powierzchni przez trypcynizację 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdź, czy komórki nie odrywają się pod mikroskopem.
4. Dezaktywuj trypsynę przez dodanie 8 ml pożywki wzrostowej do oderwanych komórek. Unikaj nadmiernej trypsynizacji, ponieważ może to niekorzystnie wpłynąć na zdrowie/żywotność komórek.
5. Pipped komórek w górę iw dół, aby wygenerować zawiesinę pojedynczej komórki i policzyć gęstość komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
6. W międzyczasie należy zrównoważyć fiolkę z NS do temperatury otoczenia.
7. Obliczyć ilość komórek potrzebną do wysiewu żądanej liczby sferoid (dołków) i podwielokrotności do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Na przykład, aby zasiać całą 96-dołkową płytkę z 5,000 komórek / studzienkę, podwielokrotność co najmniej 5,5 × 10⁵ komórek.
8. Zebrać komórki, odwirowując przy 500 x g przez 3 min. Ostrożnie zakwasić lub zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1,0 x 10⁶ komórek/ml w pożywce wzrostowej. Delikatnie pipetować za pomocą końcówki pipety z szerokim otworem, aby uniknąć ścinania. Na przykład ponownie zawieś 5,5 x 10⁵ komórek w 550 μl pożywki wzrostowej.
9. Namagnesuj żądaną liczbę komórek za pomocą zrównoważonego NS (krok 1.6).
   1. Bezpośrednio dodać NS do zawiesiny komórkowej w pożywce wzrostowej i delikatnie wymieszać. Do wydajnego znakowania magnetycznego komórek należy użyć 10 μL NS na 100 μL komórek (zawieszonych w 1 x 10⁶ komórek/ml).
      nuta: W typowym eksperymencie oznacz 5,5×10⁵ komórek Patu8902 w 550 μl 55 μl NS i 1,1×10⁶ komórek PS1 w 1100 μl, (osobno) 110 μl NS.
   2. Delikatnie odwróć rurkę kilka razy, aby zapewnić zawieszenie komórek. Tymczasowo przenieś mieszaninę komórki-NS do pojedynczego dołka na 24-dołkowej płytce. Zrób to osobno dla każdego typu ogniwa, które ma być namagnesowane. Przykryj płytkę i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, delikatnie wstrząsając, aby umożliwić NS związanie się z powierzchnią komórki.
      nuta: Hodowla i oznaczanie sferoid rozpoczynających się od samych komórek Patu8902 lub PS1, a także sferoid kokulturowych rozpoczynających się od obu typów komórek wstępnie zmieszanych przed drukowaniem na napędach magnetycznych, udało się osiągnąć przy użyciu tej metody w niezależnych eksperymentach. Metoda generowania sferoid kokulturowych z komórek Patu8902 i PS2 została opisana poniżej w kolejnych krokach.
10. Delikatnie pipetuj namagnesowane komórki w górę iw dół, aby równomiernie wymieszać i przygotuj mieszankę wzorcową zawierającą żądaną liczbę komórek. Do wysiewu sferoid użyj łącznie 15 000 komórek (5 000 Patu8902 + 10 000 PS1) i dostosuj do całkowitej objętości 150 μl na dołek 96-dołkowej płytki.
    nuta: Końcowa objętość dozowana do każdej studzienki musi być taka sama, niezależnie od liczby użytych komórek.
11. Umieść 96-dołkową płytkę odstraszającą komórki na 96-dołkowym magnetycznym napędzie sferoidalnym i dozuj 150 μl mieszanki komórek do każdej studzienki. Obserwuj, jak komórki powoli zbierają się do środka studni nad magnesem. Przykryć płytkę i inkubować ją przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 ustawionym} na temperaturę 37 °C z nadal podłączonym magnetycznym napędem sferoidalnym. Usuń napęd magnetyczny i inkubuj w celu dalszego wzrostu do 7 dni.
    nuta: Bardzo ważne jest, aby używać odstraszających komórki płytek wzrostowych do drukowania sferoidów za pomocą magnetycznych napędów sferoidalnych. Upewnij się, że używany jest napęd sferoidalny z cieńszymi mniejszymi magnesami, a nie napęd przytrzymujący.
12. Monitoruj wzrost sferoid każdego dnia. Uzupełniaj świeżą pożywką wzrostową co trzy dni, umieszczając płytkę wzrostową zamontowaną na magnetycznym napędzie przytrzymującym pod kątem i używając wielokanałowej pipety do wyciągania zużytej pożywki.
    nuta: Komórki Patu8902 i PS1 wysiane jednocześnie w ilości 15 000 komórek / studzienkę wyrosną na sferoidy 3D o średnicy 400-600 μm w ciągu 5-7 dni. W tym momencie sferoidy są gotowe do charakterystyki metabolicznej, oceny leków i innych dalszych zastosowań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% trypsyna EDTA	Sigma	25300-054
96-dołkowa płytka odstraszająca komórki	Stany Zjednoczone Naukowe/ Griener Bio-One	Numer katalogowy: 655970	sferoidalna płytka wzrostowa
Celometria Szkiełka do liczenia komórek	Nexcelom	CHT4-SD100-002
n3D Magnetyczny napęd sferoidalny	Nano3D Bioscience	655841	Część zestawu do biodruku sferoidowego
n3D Magnetic Spheroid holding stacja dysków	Nano3D Bioscience	655841	Część zestawu do biodruku sferoidowego
n3D NanoShuttle-PL	Nano3D Bioscience	655841	Część zestawu do biodruku sferoidów: przechowywać w temperaturze 4 °C
Komórki Patu8902	Zapasy laboratoryjne		gruczolakorak przewodowy trzustki Komórek
Komórki PS1	Zapasy laboratoryjne		Aktywowane komórki gwiaździste trzustki
RPMI1640	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 11875-093	pożywki wzrostowe dla komórek, sferoidy