1. Test metaboliczny sferoid 3D guza trzustki dla szlaków bioenergetycznych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego
UWAGA: W tej sekcji opisana jest analiza funkcji metabolicznych sferoid za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego z mikropłytkami testowymi specjalnie zaprojektowanymi dla sferoid 3D.
- Mycie i przenoszenie sferoid z płytek wzrostowych na mikropłytki do testów sferoidalnych.
nuta: Sferoidy mogą być używane do testów metabolicznych, gdy osiągną średnicę ~500 μm.
- Dzień przed wykonaniem testu należy uwodnić sondę lub wkład czujnika kalibrem testowym (200 μl/studzienkę) na dostarczonej płytce użytkowej i inkubować przez noc (4-18 godzin) w nawilżanym inkubatorze (bezCO2) ustawionym na temperaturę 37 °C.
- Przygotować odpowiednią pożywkę do oznaczania dla pożądanego testu metabolicznego, uzupełniając pożywkę bazową (patrz tabela materiałów) 2 mM L-glutaminy do testu wysiłkowego glikolizy (GST) lub 1 mM pirogronianu, 2 mM L-glutaminy i 10 mM glukozy do testu wysiłkowego mitochondrialnego (MST).
nuta: Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego mierzy zarówno oddychanie mitochondrialne (OCR), jak i glikolizę (ECAR) żywych komórek w formacie 96-dołkowej płytki. Wskaźniki te zapewniają przegląd funkcji metabolicznych komórek w badanych próbkach. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w instrukcji w zestawach testowych.
- Po dodaniu dodatków specyficznych dla testu (patrz krok 1.1.1), podgrzej uzupełnioną pożywkę do oznaczania w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i dostosuj pH do 7,4 ± 0,1 z 0,1 N NaOH. Utrzymuj podłoże w cieple do momentu użycia.
- Odczynniki z zestawu do oznaczania należy rozpuścić w skalibrowanym podłożu testowym do zalecanych stężeń podstawowych.
nuta: Są one wytwarzane przy 10× końcowego stężenia pożądanego w studzienkach. Podstawowe stężenia glukozy, oligomycyny i 2-deoksy-glukozy (2-DG) wynoszą odpowiednio 100 mM, 100 μM i 500 mM.
- Obserwuj sferoidy na płytce wzrostowej pod mikroskopem świetlnym, aby sprawdzić morfologię sferoidów i ogólną jednorodność, pod względem kształtu i struktury sferoidów.
- Przenieś płytkę wzrostową na magnetyczny napęd przytrzymujący i ostrożnie zassaj ~120 μl pożywki wzrostowej. Delikatnie przemyć sferoidy ~120 μL podgrzanego i wstępnie skalibrowanego podłoża testowego, odessać i powtórzyć płukanie dwukrotnie. Sprawdź ponownie sferoidy pod mikroskopem, aby upewnić się, że sferoidy nie zostały zmyte.
- Przygotować mikropłytkę do testu sferoidalnego, dodając 180 μl ciepłej pożywki do oznaczania do każdej studzienki.
- Ustaw mikropipetę P20 na 10 μl i dopasuj do niej końcówkę z szerokim otworem. Jeśli końcówki z szerokimi otworami nie są dostępne, odetnij końcówki zwykłych końcówek do pipet czystymi nożyczkami lub skalpelem, aby poszerzyć otwór.
nuta: Powinno to zmniejszyć ścinanie i zachować ogólną morfologię sferoid podczas przenoszenia na płytki testowe.
- Użyj ciepłej (37°C) powierzchni do przeprowadzenia transferu sferoid. Użyj powierzchni wizjera kliszy rentgenowskiej ogrzanej lampą światła białego, aby zwiększyć kontrast i ułatwić wizualizację sferoid podczas procesu przenoszenia.
- Ostrożnie odessać pojedynczą wstępnie umytą sferoidę z płytki wzrostu odstraszającej komórki za pomocą mikropipety P20 wyposażonej w końcówkę o szerokim otworze i delikatnie przenieść sferoidę bezpośrednio do środka każdej studzienki sferoidalnej płytki testowej w celu przeprowadzenia testu metabolicznego. Pozwól, aby każda sferoida delikatnie wpadła do centralnej mikrokomory każdej studzienki za pomocą czystej grawitacji, aby wypełnić płytkę testową.
nuta: Zwykle potrzeba 5-8 s, aby każda sferoida wpadła grawitacyjnie do środka studni. Nie wyciągaj pipety, dopóki sferoidy nie osiądą w mikrokomorze. Nie umieszczaj sferoid w 4 dołkach narożnych płytki testowej (A1, A12, H1, H12), ponieważ będą one używane jako studzienki tła.
- Monitoruj morfologię i położenie każdej sferoidy, aby upewnić się, że każda sferoida znajduje się w środku każdej studzienki. W razie potrzeby przesuń się do środka studni, odsysając sferoidę za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze, a następnie osadzając ją grawitacyjnie.
- Po przeniesieniu wszystkich sferoid umieścić płytkę testową w inkubatorze z wilgotnym powietrzem o temperaturze 37 °C (bezCO2) na jedną godzinę przed badaniem.
- Ładowanie wkładu czujnika związkami i wykonanie testu
- Przygotować 10× skoncentrowanych odczynników specyficznych dla testu w pożywce specyficznej dla testu opisanej w kroku 1.1.2. Na przykład, aby przeprowadzić GST, należy odtworzyć glukozę, oligomycynę i 2-DG w zalecanych ilościach, o których mowa w instrukcji oznaczania. Zarówno testy GST, jak i MST przeprowadzono przy użyciu sferoid Patu8902-PS1.
- Prawidłowo ustaw wkład czujnika w rzędach oznaczonych AH po lewej stronie i umieść prowadnicę ładowania na górze wkładu czujnika. Upewnij się, że żądany port jest prawidłowo załadowany, ustawiając prowadnicę załadunku tak, aby litera odpowiadająca portowi, który ma być załadowany, znajdowała się w lewym górnym rogu.
- Za pomocą pipety wielokanałowej dozuj odczynniki bezpośrednio do portów iniekcyjnych. Trzymaj prowadnice załadowcze w odpowiedniej pozycji za pomocą opuszków palców przez cały czas trwania procedury.
nuta: Każdy odczynnik zostanie wstrzyknięty do zalecanego portu, o którym mowa w instrukcji testów. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza, ale nie stukaj żadną częścią wkładu w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
- Wyjmij prowadnicę załadowczą i umieść na wysokości oczu z wkładem, aby wizualnie sprawdzić porty iniekcyjne pod kątem równomiernego ładowania.
- Należy utworzyć projekt testu eksperymentalnego/protokół przyrządu za pomocą oprogramowania Wave sterownika przyrządu (zwanego dalej oprogramowaniem do analizy), jak opisano w sekcji 1.3.
- Projektowanie i wykonywanie testów za pomocą oprogramowania analitycznego
- Tworzenie szablonu testu dla eksperymentu
- Otwórz oprogramowanie analityczne i kliknij "Szablony" lub wybierz jeden z istniejących szablonów testów. Kliknij dwukrotnie "Pusty szablon".
- Zdefiniuj grupy i warunki eksperymentalne.
- Zdefiniuj strategie iniekcji dla portów A, B i C. Pozostaw port D pusty.
nuta: W przypadku testu GST tylko te porty zostaną załadowane glukozą, oligomycyną i 2-DG. W przypadku testu MST zostanie załadowana oligomycyna, FCCP i rotenon.
- Określić obróbkę wstępną, jeśli sferoidy były traktowane jednym lub więcej badanymi związkami i grupą kontrolną. Zdefiniuj podłoże testowe, aby uwzględnić źródło, suplementy i inne informacje.
- Zdefiniuj jeden lub więcej typów komórek (np. Patu8902, PS1), wyświetlając informacje o gęstości i liczbie przejść.
- Kliknij "Generuj grupy".
- Kliknij zakładkę "Mapa płyt" i przypisz grupy do płytki testowej odpowiadającej projektowi doświadczalnemu.
- Wybierz cztery studzienki narożne jako studzienki tła. Upewnij się, że w tych studzienkach nie ma sferoid.
- Uruchamianie testu na analizatorze
- Kliknij na zakładkę Instrument Protocol (Protokół przyrządu). Zachowaj domyślne polecenia protokołu, zaznaczając opcje "Kalibruj", "Równoważ" i "Podstawowy cykl pomiarowy".
- Kliknij "Wtryski" i zdefiniuj związek dla każdego portu. Edytuj cykle pomiarowe na 6 cykli z domyślnych 3 cykli dla sferoid. Zachowaj domyślne 3-minutowe mieszanie, 0 min oczekiwania i 3-minutowe czasy pomiaru.
nuta: Domyślne czasy mieszania, oczekiwania i pomiaru to odpowiednio 3 min, 0 min, 3 min. Przed wstrzyknięciem pierwszego związku testowego zwykle wykonuje się trzy pomiary dawki podstawowej. Pomiary te można kalibrować i ponownie korygować zgodnie z projektem eksperymentalnym.
- Protokół przeglądu i podsumowanie grupy.
- Zapisz szablon projektu testu.
- Przejdź do kalibracji przed testem po załadowaniu portów iniekcyjnych substratami testowymi. Przenieść wkład z tabliczką użytkową do analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.
nuta: Zwykle odbywa się to w ciągu 15-20 minut i kalibruje czujniki w celu przeprowadzenia pomiarów OCR i ECAR.
- Po kalibracji wkładu należy wymienić tabliczkę użytkową na wstępnie podgrzaną płytkę testową zawierającą sferoidy 3D i rozpocząć test. Po zakończeniu pomiarów wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyki, aby przeanalizować dane.
