Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek macierzystych PDAC: metoda izolowania rakowych komórek macierzystych z guzów trzustki

30 kwietnia 2023

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Lonardo, E., et al. Badanie cech komórek macierzystych raka trzustki w celu opracowania nowych strategii leczenia. J. Vis. Exp. (2015).

Ten artykuł opisuje technikę izolowania komórek macierzystych raka trzustki (CSC) z ludzkiej tkanki gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC). Te CSC są wykorzystywane do badania funkcjonalnego wpływu leczenia farmakologicznego na zdolność CSC do samoodnawiania się in vitro w celu opracowania bardziej skutecznych metod leczenia raka.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja CSC od ludzkiego PDAC (Rysunek 1)

  1. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieś ludzką tkankę PDAC do naczynia hodowlanego o wymiarach 60 x 15 mm zawierającego 1 ml sterylnego soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X (PBS). Zmiel guz na małe kawałki (1 - 5 mm) za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy.
  2. Dodaj 1 ml sterylnego 1X PBS do naczynia hodowlanego i powtarzaj etap rozcierania, aż tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana, zwykle wymaga to 3-4 rund. Przenieść zawiesinę tkankową (uzupełnić do końcowej objętości 5 ml za pomocą 1X PBS) do sterylnej probówki i mechanicznie homogenizować za pomocą dysocjatora, takiego jak gentleMACS.
  3. Inkubować homogenizowaną tkankę z kolagenazą (użyć 2,5 mg/ml kolagenazy w 1X PBS) przez 60 minut w temperaturze 37°C, a następnie wirować przez 5 minut przy 900 x g. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 10 ml kompletnej pożywki. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 40 μm i odwirować przez 5 minut przy 900 x g.
  4. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad z 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (chlorek amonu i potasu, ACK), a następnie inkubować
  5. Zawiesić osad w pożywce CSC, rozłożyć na szalce pokrytej żelatyną i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Ten krok usunie większość komórek fibroblastów, które szybko przyczepiają się do płytki.
  6. Wyjąć płytkę z inkubatora i ostrożnie odzyskać zawiesinę komórek oraz określić ilościowo liczbę żywotnych (trypanowo-niebieskoujemnych) komórek za pomocą hemocytometru. W tym celu delikatnie wymieszać zawiesinę i odpipetować 20 μl zawiesiny do probówki Eppendorfa. Dodać 20 μl (stosunek 1:1) błękitu trypanowego do komórek w probówce do mikrowirówki i dobrze wymieszać. Pobrać pipetą około 10 μl mieszaniny na hemocytometr.
  7. Policz wszystkie czyste komórki w czterech rogach komory liczącej, aby zliczyć żywotne komórki.
    nuta: Żywotność i wydajność komórek może się znacznie różnić w zależności od próbki guza. W przypadku próbek PDAC żywotność regularnie waha się między 45-70%, a fragmenty tkanki z makroskopowej próbki guza o średnicy 3 - 5 mm powinny dać około 5x106 żywotnych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1. Metformina jest selektywnie ukierunkowana na CSC.
(A) Metformina zmniejszała rozmiar kulek. Reprezentatywne obrazy kulek uzyskane po leczeniu wskazanymi dawkami metforminy przez 7 dni (prawy panel). Kwantyfikacja wielkości kuli (n≥6) (lewy panel), wskazane liczby na osi odciętych reprezentują pojedynczy guz. (B) Zdolność do tworzenia kulek w obecnośc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora licząca/
Hemocytometr 		Hausser Scientific Co3200
Licznik i analizator komórek CASY do pomiaru proliferacji i żywotnościRoche InnovatisAG CASY Model TTC 45,60,150 μm
Dysocjator GentleMACSMiltenyi Co130-093-235
Rurki GentleMACS CMiltenyi CoNumer katalogowy: 130-093-237
Szalki do hodowli tkankowych o średnicy 100 mmBD Sokół353803
Sitko do komórekBD SokółNumer katalogowy: 352350
15-ml polipropylenowa tuba stożkowaBD Sokół352097
50-ml polipropylenowa tuba stożkowaBD SokółNumer katalogowy: 352070
Sterylne probówki 1,5 mlEppendorfNumer katalogowy: 0030 120.086
Probówki wirówkowe o pojemności 50 mlCorning430828
Sterylne szalki Petriego, szalki 10 cmCorning353003
Kolagenaza typu IVTechnologie komórek macierzystychNumer telefonu 7909
Prędkość obrotowa Średnia: 1640Technologie życioweNumer katalogowy 11875-085
Roztwór penicyliny/streptomycyny, 100XTechnologie życioweSV30010
L-glutamina, 200 mM, 100XTechnologie życiowe25030-081
B27 Suplement 50xTechnologie życioweNumer katalogowy: 17504-044
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastówSigmaF0291
Zmodyfikowany Dulbecco Eagle Medium/F12SigmaZobacz materiał D8437
Sterylne 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigmaZobacz materiał D8537
Błękit trypanowyTechnologie życioweNumer katalogowy: 15250-061
Inkubator z dopływem CO2
Mikro nożyczki
Zakrzywione kleszcze
Kleszcze do odłamków
szt. powiedział: TGL powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Macierzyste kom rki nowotworu trzustkiizolacja CSCdysocjacja tkanki nowotworowejtrawienie kolagenazp ytka pokryta elatynywotno z b kitem trypanuliczenie w komorze counting chamberbufor lizuj cy ACKpo ywka wzrostowa CSCusuwanie fibroblast w

Powiązane artykuły