Test tworzenia kuli: metoda in vitro do identyfikacji komórek macierzystych raka trzustki i terapii przesiewowych

Streszczenie

Źródło: Lonardo, E. et al. Badanie cech komórek macierzystych raka trzustki w celu opracowania nowych strategii leczenia. J. Vis. Exp.(2015).

Ten film demonstruje protokół rozwoju sferoidów komórek macierzystych raka trzustki in vitro. Test może służyć jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które potencjalnie celują w rakowe komórki macierzyste.

Protokół

1.Test i analiza formowania kul

1. Test tworzenia kulek i leczenie metforminą
   1. Pobrać wymaganą liczbę komórek i dodać odpowiednią objętość pożywki CSC, aby uzyskać stężenie komórek 2 000 komórek/ml. Nie przechowywać zawiesiny komórek na lodzie nie dłużej niż 1 godzinę i dobrze wymieszać przed posiewem.
   2. Dodaj 500 μl 1X PBS do pierwszego i ostatniego rzędu 24-dołkowej płytki w celu nawilżenia, aby zminimalizować parowanie medium. Zasiej komórki na płytki komórek o bardzo niskim przyczepie o gęstości 2,000 komórek na studzienkę w 1 ml pożywki z kuli nowotworowej (2,000 komórek/ml).
      nuta: Liczba komórek używanych do testów tworzenia sfery nowotworowej może się różnić w zależności od typu nowotworu.
   3. Poddać działaniu co najmniej 4 studzienki nośnik (kontrola ujemna) i 4 studzienki każdemu przydzielonemu zabiegowi, np. 3 mM metforminy. Umieścić komórki w inkubatorze ustawionym na temperaturę 37 °C i dostarczać do komórek 5% CO₂ przez tydzień.
      nuta: Pożywka nie powinna być zmieniana, aby umożliwić niezakłócone tworzenie się kulek nowotworowych, ale może być codziennie uzupełniana czynnikami wzrostu, ponieważ nie są one stabilne w pożywce hodowlanej.
   4. Co drugi dzień dodawać leczenie, np. 3 mM metforminy lub nośnika do każdej ze studzienek. Oceń liczbę utworzonych kul guza po 5 i/lub 7 dniach za pomocą automatycznego licznika komórek, który pozwala na zliczanie większych struktur (ryc. 1).
      nuta: Należy brać pod uwagę tylko sfery nowotworowe o wielkości co najmniej 40 μm, które można sklasyfikować odpowiednio jako małe (40 - 80 μm) lub duże (80 - 120 μm). Wyniki można zilustrować jako procent sfer nowotworowych podzielony przez początkową liczbę zasianych komórek (np. 2000 komórek).
2. Seryjne pasażowanie kul nowotworowych pierwszej generacji
   1. Po 7 dniach inkubacji należy zebrać kule nowotworowe za pomocą sitka do komórek 40 μm i odwirować je przez 5 minut przy 900 x g w temperaturze pokojowej.
   2. Dysocjuj osad kul nowotworowych na pojedyncze komórki za pomocą trypsyny, a następnie ponownie rozszerz otrzymaną zawiesinę pojedynczych komórek komórkowych przez kolejne 7 dni.

Wyniki

Rysunek 1. Leczenie metforminą hamuje zużycie tlenu i indukuje produkcję ROS. (A) Ponadto metformina hamuje zużycie tlenu (OCR) przez komórki pochodzące z kuli. Dwie różne sfery drugorzędowe PDAC potraktowano metforminą, a zmiany OCR mierzono za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Iniekcja rotenonu była stosowana jako kontrola całkowitego zużycia mitocho...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
24-dołkowe płytki mocujące o bardzo niskim	Corning	3474
Sterylne 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco	Sigma	Zobacz materiał D8537
Metformina	Sigma	D150959-5G
Roztwór trypsyny, 0,05%	Technologie życiowe	25300054
Inkubator z dopływem CO2
Licznik i analizator komórek CASY do pomiaru proliferacji i żywotności	Roche Innovatis	AG CASY Model TTC 45,60,150 μm
Komora zliczająca/ hemocytometr	Hausser Scientific Co	3200
Probówki wirówkowe o pojemności 50 ml	Corning	430828
15-ml polipropylenowa tuba stożkowa	BD Sokół	352097
50-ml polipropylenowa tuba stożkowa	BD Sokół	Numer katalogowy: 352070

poziomie TGL szt.