1. Przygotowanie sferoid 3D Guza Osadzonych w ECM
- Przygotuj stanowisko pracy z potrzebnymi materiałami w okapie z przepływem laminarnym.
- Przygotować rozcieńczoną mieszaninę fluorescencyjnych sond znacznikowych modyfikowanych karboksylanem o średnicy 1 μm, dodając 2 części sond podstawowych (2% ciał stałych) do 25 części sterylnej wody.
- Wyjmij butelkę z 3,1 mg/ml kolagenu bydlęcego z lodówki i umieść ją na lodzie.
- Porcję 125 μl kolagenu do pustej fiolki o pojemności 2 ml.
- Dodać 50 μl rozcieńczonego roztworu sondy znacznikowej do fiolki zawierającej kolagen i krótko odwirować, aby rozprowadzić sondy.
- Dodać 235 μl odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych zawierającej czerwień fenolową (która zmieni kolor na żółty) o łączną objętość 410 ml i krótko przemieszać przed wyjęciem 205 ml (połowa całkowitej objętości) i umieszczeniem jej w nowej fiolce o pojemności 2 ml. Fiolka 1 będzie zawierała sferoid guza, a fiolka 2 będzie mieszaniną kontrolną.
- Dodać ~ 2 μl 1 M NaOH do fiolki 1, aby przywrócić roztwór do neutralnego pH (pożywka hodowlana zawierająca czerwień fenolową powinna powrócić do czerwieni). Należy pamiętać, że spowoduje to, że mieszanina zacznie się utwardzać, jeśli nie będzie trzymana na lodzie. Krótko zmieszać, a następnie natychmiast wrócić do stojaka na lód.
nuta: Sferoida jest ledwo widoczna gołym okiem po 9 dniach hodowli, a jej usunięcie z łoża agarozy jest delikatnym zadaniem. Korzystanie z mikroskopu preparacyjnego może być pomocne dla niektórych użytkowników. Utrzymanie integralności sferoidy podczas przenoszenia ma kluczowe znaczenie.
- Za pomocą końcówki pipety z szeroką szyjką delikatnie usuń 40 μl pożywki ze studzienki zawierającej sferoidę guza. Zachowaj te 40 μl podczas wykonywania następnego kroku.
- Sprawdź studnię, aby zobaczyć, czy sferoida została usunięta w poprzednim kroku. Jeśli tak, dodaj 40 μl zawierające sferoidę do fiolki 1. Jeśli nie, umieść 40 μl z powrotem w studzience i powtórz poprzedni krok.
- Delikatnie wymieszać fiolkę 1 (nie ryzykować wirowania, może to spowodować uszkodzenie sferoidy) przed przeniesieniem mieszaniny w porcjach 60 μl do trzech oddzielnych dołków na 96-dołkowej płytce. Po dodaniu mieszaniny sprawdź każdą studzienkę pod mikroskopem, aby określić, która studzienka zawiera sferoidę.
- Dodać ~2 μl 1 M NaOH i 40 μl pożywki do hodowli komórkowej do fiolki 2 i odwirować przed porcjowaniem 60 μl tej mieszaniny do pustego dołka na płytce 96-dołkowej i etykietowaniem jako kontrola.
- Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C do utwardzania przez co najmniej 1 godzinę.
2. Skonstruuj siatkę punktów próbkowania i nagraj film w każdym punkcie
- Przenieść płytkę z próbką z inkubatora na stolik mikroskopowy. Odczekać 10 minut, aby próbka zrównoważyła się z temperaturą pokojową, jeżeli podgrzewany stage nie jest dostępny.
- Obserwuj próbkę za pomocą soczewek obiektywowych o małej mocy, aby upewnić się, że jest nienaruszona i gotowa do obrazowania. Określ położenie guza w studni.
- Zdecyduj, ile punktów próbkowania chcesz pobrać. Zazwyczaj 20 punktów próbkowania w każdym dołku, rozmieszczonych w koncentrycznych pierścieniach wokół sferoidy, daje odpowiednio szczegółowe wyniki.
- Przesuń stolik do każdej żądanej pozycji i użyj oprogramowania do łączenia mikroskopów, aby zarejestrować współrzędne x i y (lub zarejestrować współrzędne ręcznie, jeśli oprogramowanie do łączenia jest niedostępne).
- Przełącz mikroskop na soczewkę obiektywową o dużej mocy (zwykle 100X) i wybierz odpowiednią kostkę filtrującą dla długości fali wzbudzenia sond znacznikowych. Użyj listy punktów utworzonych w kroku 2.4, aby przejść do pierwszego punktu w siatce.
- Dostosuj ostrość, aby znaleźć dno studzienki, a następnie przesuń w górę, aby znaleźć pole widzenia (fov) zawierające kilka ostrych sond śledzących.
- Obserwuj histogram intensywności i dostosuj intensywność i czas ekspozycji, aby uzyskać jak największy zakres dynamiki, jednocześnie upewniając się, że obraz nie zostanie nasycony.
- Uzyskaj sekwencję wideo z szybkością 20-30 ms na klatkę (zaleca się około 800 klatek lub 16-24 sekundy, aby zapewnić wystarczające statystyki do solidnych obliczeń MSD, zrównoważone potrzebą zminimalizowania czasu akwizycji w każdym punkcie siatki przestrzennej) i zapisz z odpowiednią konwencją. Podczas nagrywania nie dotykaj mikroskopu ani stołu.
- Powtórz kroki od 2.6 do 2.9 dla każdego punktu próbkowania w siatce.
- Powtórz kroki od 2.3 do 2.10 dla każdego dołka w eksperymencie.
