1. Przygotowanie hodowli komórkowej i przygotowanie do eksperymentu
- Utrzymuj ludzkie komórki raka jelita grubego, HCT-116 zgodnie z zaleceniami dostawcy, w monowarstwach w kolbach hodowlanych o długości 75cm2 zawierających 10 ml zmodyfikowanej pożywki McCoy's 5a Medium, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym.
- Hoduj komórki w nawilżonym środowisku o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C aż do 70% zbiegu z odnawianiem pożywki co 2 do 3 dni.
- Aby uzyskać wiązkę BNCT (np. wiązka neutronów plus BPA) i efekt BNCT polegający na zabijaniu komórek rakowych w postaci ciężkich cząstek i zdeponowaniu większości ich energii w komórkach rakowych zawierających bor, dzień przed napromienianiem dodaj do pożywki do hodowli komórkowej środek dostarczający bor – np. 10BPA, 4-Borono-L-fenyloalanina (10 μg 10B/ml, 0,925 mM końcowy) 12–16 godzin (maksymalny pobór boru) przed napromieniowaniem.
nuta: W przypadku stosowania innej linii komórkowej, dla której nie ma danych w przypadku badania BNCT, należy zbadać wychwyt boru dla każdej linii komórkowej, aby uzyskać optymalne stężenie boru. Zmierz wychwyt komórkowy BPA za pomocą optycznej spektroskopii emisyjnej z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-OES), jak to ma miejsce w grupie Dagrosa.
- Po 12-16 godzinach dostarczania boru, odessać pożywkę i umyć komórki 10 ml 1x PBS. Następnie trypsynizuj komórki, dodając 2 ml roztworu trypsyny-EDTA do komórek i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aby zwiększyć odwarstwienie komórek. Kiedy komórki zaczną się odłączać, zatrzymaj działanie trypsyny, dodając 10 ml kompletnej pożywki.
- Odessać zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml i policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, dodając 10 μl 0,4% błękitu trypanowego do 10 μl komórek, wymieszać i podać 10 μl na szkiełku liczącym. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do stężenia 1 x 106 komórek/ml pożywki. Podwielokrotność 1 ml zawiesiny komórek na krioprobówkę.
- Przygotować dozymetry termoluminescencyjne (TLD) do pomiaru dawek promieniowania gamma oraz złote folie do fluencji neutronów i przymocować TLD do krioprobówek lub kolby do hodowli komórkowych przed napromienianiem.
- Napromieniować 1 x 106 komórek/ml wiązką zmieszaną z neutronami przy zalecanym minimalnym strumieniu neutronów termicznych 5,9 x 1011 (n/cm-2 min-1)4 w kolbach hodowlanych lub krioprobówkach, w zależności od możliwości obiektu.
nuta: Ustaw wcześniej czas napromieniowania, aby uzyskać zalecany strumień neutronów.
- Po napromienieniu rozsiać 1 ml napromienionych komórek (1 x 106 komórek/ml) na szkiełkach nakrywkowych o wymiarach 22 x 22 mm na szalkach Petriego o średnicy 35 mm lub płytkach 6-dołkowych, uzupełnić 2 ml wymaganej pożywki. Inkubować komórki przez maksymalnie 3 godziny w temperaturze 37 °C w środowisku nawilżonym o stężeniu 5% CO2 , aby mogły przymocować się do szkiełek nakrywkowych. Od czasu do czasu obserwuj przyczepienie komórek pod mikroskopem odwróconym z obiektywem 20x.
nuta: W przypadku komórek HCT-116 minimalna gęstość wynosi 600 000 komórek do wysiewu. Aby uzyskać szybką dalszą procedurę barwienia, użyj szkiełek komorowych, odpowiednio zmniejsz gęstość komórek.
2. Utrwalenie komórek
- Po napromieniowaniu i inkubacji komórek usunąć pożywkę z przyłączonych komórek i przemyć komórki raz 2,5 ml PBS.
- Utrwal komórki za pomocą 1 ml 70% etanolu przez 10 minut w RT.
nuta: Alternatywnie użyj 1%-3,7% paraformaldehydu (PFA) do utrwalenia, zgodnie z wcześniejszymi zaleceniami. W tym miejscu protokół jest wstrzymany. Utrwalone komórki należy przechowywać w etanolu w zamrażarce w temperaturze -20°C nie dłużej niż kilka tygodni w celu dalszej analizy i barwienia immunofluorescencyjnego.
3. Przepuszczalność komórek
- Po utrwaleniu usunąć etanol z szalki Petriego i przemyć 2,5 ml 1x PBS.
nuta: Nie pozwól, aby komórki wyschły między etapami płukania.
- Delikatnie dodaj 1 ml 0,2% Triton X-100/PBS, aby pokryć szkiełka nakrywkowe komórkami na szalkach Petriego.
- Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj komórki 3x 2,5 ml 1x PBS.
nuta: W razie potrzeby zwiększ zawartość procentową Triton X-100 w PBS do 0,5% (więcej wykrywalnych ognisk, w zależności od badanej linii komórkowej). Wykonaj dodatkowe prania za pomocą PBST (PBS z 0,5% Tween), aby uniknąć niespecyficznego wiązania.
- Zablokować etap przepuszczalności za pomocą 1 ml 2% albuminy BSA (albuminy frakcji V surowicy bydlęcej) rozcieńczonej w PBS i inkubować przez co najmniej 30 minut lub 1 godzinę z 1% BSA.
nuta: Ten krok można pominąć i jest on zależny od rodzaju zastosowanego przeciwciała. Alternatywnie użyj 5% FBS zgodnie z zaleceniami.
4. Barwienie immunofluorescencyjne
- Dodać odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs i Anti-Rad52) rozcieńczonego w PBS z BSA (2% albumina frakcji V surowicy bydlęcej) zgodnie z zaleceniami (patrz Tabela 1 z zalecanymi rozcieńczeniami) (potrzeba 100 μl na próbkę).
pkt.
)
pkt.
pkt.
| Przeciwciało pierwszorzędowe | funkcja | Zalecane rozcieńczenie | Przechowywanie [°C] |
| Anty-ɣ-H2AX | wykrywanie DNA-DSB | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anty-DNA-PKcs | wykrywanie RIF białka DNA-PKcs należącego do NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anty-Rad52 (wersja anty-Rad52 | wykrywanie RIF białka Rad52 należącego do HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Przeciwciało drugorzędowe | | w ciemności | |
| anty-mysie IgG FITC | Ogniska ɣ-H2AX | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Kozia anty-królicza IgG H&L (Alexa Fluor 488) | dla ognisk naprawczych białek NHEJ i HRR | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tabela 1: Zalecane rozcieńczenia i uwagi dotyczące stosowania przeciwciał stosowanych w sekcji
- Przykryj szalkę Petriego, aby utrzymać wilgotność, w plastikowym pudełku z nawilżoną ligniną za pomocą wody destylowanej i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Inkubację można przeprowadzać w temperaturze 4 °C przez noc.
- Po inkubacji wykonać 3 płukania z użyciem 2,5 ml PBS.
nuta: Nie dopuścić do wyschnięcia szkiełka podczas etapów płukania.
- Dodać odpowiednią ilość przeciwciała drugorzędowego (anty-mysie IgG FITC, Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) rozcieńczonego w PBS z BSA (patrz Tabela 1) (potrzeba 100 μl na próbkę). W tym i następnych krokach pracuj w ciemności.
- Ponownie przykryć szalkę Petriego w celu utrzymania wilgotności w plastikowym pojemniku z nawilżoną ligniną i inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
- Po inkubacji wykonaj 3 przemycia 2,5 ml PBS.
- Dodać 100 μl DAPI rozcieńczonego w PBS do końcowego stężenia 1 μg/ml w celu przeciwbarwienia jąder.
- Inkubować krótko przez maksymalnie 2 minuty w temperaturze pokojowej.
- Po inkubacji wykonaj 3 przemycia 2,5 ml PBS.
- Usuń PBS i delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na wierzch podłoża montażowego, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza, a następnie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Poczekaj, aż lakier wyschnie i pomaluj szkiełko nakrywkowe.
- Poczekaj na utwardzenie podłoża montażowego (do 3 godzin) przed analizą obrazu pod mikroskopią fluorescencyjną.
nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Szkiełka podstawowe przechowywać w plastikowym pudełku w temperaturze 4 °C w ciemności.
