1. Rozsiewanie komórek
- Wysiewać 2 x 105 komórek HCT116 raka jelita grubego na basenie na 24-dołkowej płytce i utrzymywać komórki w zmodyfikowanym podłożu Eagle (DMEM) firmy Dulbecco przez noc w temperaturze 37 °C.
- Zastąp pożywkę lub bez niej 100 μM siarczanu żelazawego (FS) lub 10 μM doksorubicyny (DOX) zawierającej pożywkę i inkubuj przez 24 godziny.
2. Przygotowanie roztworu DCFH-DA
- Rozpuścić 4,85 mg DCFH-DA w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu uzyskania 10 mM roztworu podstawowego.
- Rozcieńczyć roztwór podstawowy wstępnie podgrzanym DMEM w roztworze roboczym o stężeniu 10 μM tuż przed dodaniem go do studzienek.
- Wiruj roztwór roboczy przez 10 sekund.
3. Barwienie DCFH-DA
- Usuń pożywkę zawierającą lek i przemyj raz DMEM.
- Dodać 500 μl roztworu roboczego DCFH-DA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Usuń roztwór roboczy DCFH-DA. Przemyć raz DMEM i 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS).
- Dodaj 500 μl 1x PBS do każdej studzienki.
4. Akwizycja obrazowania i pomiar intensywności
- Wykonaj reprezentatywne obrazy fluorescencyjne dla każdej studzienki przy użyciu kanału białka zielonej fluorescencji (GFP) na mikroskopie fluorescencyjnym.
- Po wykonaniu zdjęć usuń PBS i dodaj 200 μl buforu do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) do każdej studzienki.
- Inkubować na lodzie przez 5 minut, a następnie zebrać lizat komórkowy do probówek o pojemności 1,5 ml.
- Wirować przy 21,130 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Przenieść 100 μl supernatantu na czarną 96-dołkową płytkę i zmierzyć intensywność fluorescencji za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 530 nm.
- Przenieść 1 μl supernatantu na przezroczystą 96-dołkową płytkę zawierającą 100 μl 1x roztworu do oznaczania białek w celu zmierzenia stężenia białka za pomocą testu Bradforda.
- Normalizuj intensywność fluorescencji za pomocą stężeń białek.