Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Hodowla linii komórkowych
- Hoduj komórki HK w kompletnym pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 nM glutaminą, 100 U/ml penicyliny G i 100 mg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w 5% nawilżanym inkubatorzeCO2.
nuta: Komórki HK są normalnymi ludzkimi pęcherzykowymi komórkami dendrytycznymi i mogą być hodowane i namnażane przez ≤ 15 pasaży in vitro.
2. Znakowanie i wzbogacanie guzów znakowanych lucyferazy
- Wszczepić guzy bezpośrednio w lewą i prawą flankę 6-8 tygodniowych samic myszy NOD / SCID.
- Mierz wzrost guza co dwa tygodnie za pomocą suwmiarki cyfrowej.
- Przy średnicy 1 cm transdukować guz. Bezpośrednio wstrzyknąć do guza pojedynczą dawkę lentiwirusa Luc/czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP) (50 μl/guz, rozcieńczenie 1:30 ze skoncentrowanego lentiwirusa o wysokim mianie) za pomocą strzykawki o pojemności 1 cm3 z igłą 27 G.
nuta: Guz pacjenta zwykle osiąga 1 cm średnicy w ciągu 1-2 miesięcy. Jednak tempo wzrostu jest niezwykle zmienne i opiera się na wielu czynnikach, w tym stopniu zaawansowania i rodzaju guza.
3. Model myszy CRC
- Znieczulij sześcio- do ośmiotygodniowego samca myszy NOD/SCID izofluranem (2,5% w 100% tlenu, 1 l/min) w komorze indukcyjnej. Potwierdź sedację szczyptą palca u nogi.
- Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej pod mikroskopem preparacyjnym, upewniając się, że jej pysk jest przymocowany do stożka nosowego izofluranu, a przednie kończyny taśmą zapewniającą stabilność.
nuta: Lupy mogą być używane zamiast mikroskopu preparacyjnego. Mały przedmiot może być użyty do poprawy widoczności i kąta po umieszczeniu pod podstawą ogona, podnosząc odbyt. Zazwyczaj małe odcinki gazy są zwijane w kształt walca o średnicy 1 cala.
- Rozszerz kanał odbytu za pomocą zakrzywionych, nasmarowanych, tępo zakończonych kleszczy, aby odsłonić dystalną błonę śluzową odbytu i odbytnicy. Usuń kał.
- Użyj sterylnej wyjmowanej igły 30 G na szklanej strzykawce o pojemności 50 μl, aby wstrzyknąć 10 μl komórek nowotworowych znakowanych lucyferazy i komórek HK (ponownie zawiesić 10 μl komórek nowotworowych na mysz dla modelu CRC w kompletnym pożywce RPMI) do dystalnej tylnej tylnej błony podśluzowej odbytnicy, 1 do 2 mm powyżej kanału odbytu. Skos igły powinien być pokryty błoną śluzową. Uważaj, aby nie dostać się do jamy miednicy.
- Wyjmij mysz ze stożka nosowego izofluranu. Obserwuj go przez 1 godzinę po zabiegu. Szukaj oznak niepokoju, np. zgarbionych pleców, ciężkiego oddychania itp.
4. Obrazowanie bioluminescencyjne
- Monitoruj co tydzień pierwotne obciążenie przerzutami do wątroby i płuc za pomocą bioluminescencyjnego systemu obrazowania pod kątem aktywności lucyferazy.
- Zdobądź eksperyment CRC na myszy i zważ. Wstrzyknąć dootrzewnowo 150 mg/kg lucyferyny i odczekać 5 minut, aż substrat zacznie krążyć w organizmie myszy.
- Znieczulić mysz 2,5% izofluranem w 100% tlenie, 1 l/min w komorze indukcyjnej.
- Umieść mysz w maszynie do obrazowania BLI z nosem zamocowanym w stożku nosowym. Podczas naświetlania obrazu upewnij się, że obszar zainteresowania jest skierowany w stronę aparatu. W przypadku iniekcji CRC strona brzuszna powinna być skierowana w stronę kamery dla każdego obrazu. Wyobraź sobie mysz w pozycji leżącej.
