$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie huA33-TCO
UWAGA: Synteza huA33-TCO została już wcześniej opisana. Jednak dla wygody czytelnika jest on tutaj powielany z dostosowaniami do optymalnych warunków.
- W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotować 125 μl roztworu węglanu (E)-cyklooct-4-enylu 2,5-diokso-1-pirolidynylu (TCO-NHS) w suchym dimetyloformamidzie (DMF) w stężeniu 40 mg/ml (0,15 M). Roztwór ten można podzielić na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C w celu wykorzystania w przyszłych doświadczeniach.
- W oddzielnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotuj roztwór huA33 o stężeniu 5 mg/ml w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 2,7 mM chlorek potasu, 137 mM chlorek sodu i 11,9 mM fosforan potasu, pH 7,4).
- Stosując małe podwielokrotności (<5 μL) 0,1 M Na2CO3 dostosować pH roztworu przeciwciała z kroku 1.2 do 8.8-9.0. Do monitorowania pH należy używać papieru do pomiaru pH lub pH-metru z mikroelektrodą i uważać, aby pH nie przekraczało 9,0.
- Do roztworu przeciwciała opisanego w kroku 1.3 powoli dodawać objętość odpowiadającą 40 równoważnikom molowym TCO-NHS w stosunku do ilości przeciwciała. Na przykład, jeśli w roztworze znajduje się 5 mg (30 nmol) huA33, dodaj 9,0 μl (1,20 μmol) roztworu 40 mg/ml (0,15 M) TCO-NHS.
nuta: TCO-NHS jest hydrofobowy. Dodając go do roztworu przeciwciała, dodawaj go powoli i z mieszaniem, aby zapobiec wytrącaniu się. Nie przekraczać 10% objętości DMF w końcowym roztworze reakcyjnym.
- Pozostawić reakcję do inkubacji w temperaturze 25 °C na termomikserze przez 1 godzinę z łagodnym mieszaniem (500 obr./min).
- Po 1 godzinie oczyścić immunokoniugat huA33-TCO za pomocą wstępnie zapakowanej jednorazowej kolumny odsalającej z wykluczeniem wielkości.
- Zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość zgodnie z opisem dostawcy, aby usunąć wszelkie konserwanty obecne w kolumnie podczas przechowywania. Typowa procedura polega na przemyciu kolumny 5x objętością PBS odpowiadającą objętości kolumny: 5 x 2,5 ml PBS.
- Dodać mieszaninę reakcyjną do kolumny wykluczającej rozmiar, zwracając uwagę na objętość mieszaniny reakcyjnej.
- Po wprowadzeniu mieszaniny reakcyjnej do kolumny dodać odpowiednią ilość PBS, aby całkowita objętość roztworu dodanego do kolumny wynosiła 2,5 ml. Na przykład, jeśli reakcja koniugacji dała całkowitą objętość 1,3 ml, dodaj 1,2 ml dodatkowego PBS do kolumny.
- Zebrać produkt, używając 2 ml PBS jako eluentu.
nuta: Ten krok pozwoli uzyskać ostateczną konstrukcję huA33-TCO w 2 ml PBS, pH 7,4.
- Zmierzyć stężenie huA33-TCO za pomocą spektrofotometru UV-Vis monitorującego długość fali 280 nm. Współczynnik ekstynkcji molowej dla większości IgG (ε280) wynosi 210 000 M-1 cm-1.
- Jeśli pożądany jest roztwór o wyższym stężeniu immunokoniugatu, należy stężyć roztwór huA33-TCO za pomocą odśrodkowej jednostki filtrującej z granicą masy cząsteczkowej 50 000 zgodnie z instrukcjami producenta.
nuta: Wiadomo, że wiele przeciwciał agreguje się lub wytrąca podczas koncentracji. Podejmując próbę przeprowadzenia tej procedury z nowym przeciwciałem, badacze powinni odwołać się do literatury lub własnego doświadczenia w pracy z danym przeciwciałem.
- Gotowy immunokoniugat huA33-TCO należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności, jeśli jest natychmiast potrzebny. Jeśli ma być używany dłużej niż 4 dni w przyszłości, przechowuj go w temperaturze -80 °C w ciemności.
nuta: Jest to akceptowalny punkt zatrzymania procedury. Gotowy immunokoniugat huA33-TCO powinien być stabilny przez co najmniej 6 miesięcy przechowywania w temperaturze -80 °C w ciemności.
2. Synteza Tz-PEG 7-NHBoc
- W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml rozpuść 5 mg estru N-hydroksysukcynimidylu tetrazyny (Tz-NHS; 12,6 μmol) w 0,15 ml bezwodnego dimetylosulfotlenku (DMSO).
- W oddzielnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml rozpuścić 8 mg chronionego przed Boc polimeru amino PEG, glikolu O-(2-aminoetylo)-O'-[2-(Boc-amino)etylo]heksaetyleno]heksaetylenowego (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) w 0,15 ml bezwodnego DMSO.
- Do roztworu Tz-NHS dodać 3 μl (21,3 μmol, 1,7 ekwiwalentu molowego) trietyloaminy (TEA) i dokładnie wymieszać.
- Dodać różowy roztwór tetrazyny do roztworu NHBoc-PEG7-NH 2 z kroku 2.2 i inkubować mieszaninę reakcyjną przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) z łagodnym mieszaniem.
- Po 30 minutach rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną w stosunku 1:1 wH2Oi oczyścić ją za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami C18 w celu oddzielenia nieprzereagowanego Tz-NHS od Tz-PEG 7-NHBoc. Stosować rozpuszczalniki bez kwasu, aby zapobiec przedwczesnemu usunięciu grupy ochronnej Boc. Monitoruj zarówno Tz-PEG 7-NHBoc, jak i Tz-NHS na długości fali 525 nm.
nuta: Czasy retencji są w dużym stopniu zależne od wyposażenia HPLC każdego laboratorium (pompy, kolumny, rurki itp.), a przed oczyszczaniem należy przeprowadzić odpowiednie kontrole. Jednakże, aby przedstawić przykład, jeśli stosuje się gradient od 5:95 MeCN/H2O (oba bez żadnego dodatku) do 95:5 MeCN/H2O w ciągu 30 minut, natężenie przepływu 1 ml/min i analityczną kolumnę C18 o wymiarach 4,6 mm x 250 mm, czasy retencji Tz-NHS i Tz-PEG 7-NHBoc wynoszą około 16 min i 18 min, odpowiednio.
- Zamrozić zebrany eluent HPLC za pomocą ciekłego azotu i owinąć zamrożoną probówkę zbiorczą folią aluminiową. Umieść zamrożoną probówkę zbiorczą na liofilizatorze na noc, aby usunąć ruchomą fazę HPLC. Produkt będzie charakterystycznym jasnoróżowym ciałem stałym.
nuta: Jeżeli ciekły azot jest niedostępny, należy zamrozić zebrany eluent HPLC w suchym lodzie lub na noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
3. Synteza Tz-PEG7-NH 2
- Do produktu z kroku 2.6, Tz-PEG 7-NHBoc, dodać 1,5 ml dichlorometanu (DCM) i przenieść ten roztwór do małej kolby okrągłodennej.
- Dodać kroplami 0,25 ml kwasu trifluorooctowego (TFA) do różowego roztworu z kroku 3.1.
- Pozostawić reakcję do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.
- Po 30 minutach odparować rozpuszczalnik poprzez odparowanie obrotowe. Nie przekraczać temperatury łaźni wodnej wynoszącej 37 °C.
- Rozpuścić różowy lepki produkt w 0,5 ml wody.
- Oczyścić produkt za pomocą HPLC C18 z odwróconymi fazami w celu oddzielenia Tz-PEG7-NH 2 od prekursora chronionego przed Boc. Monitoruj zarówno Tz-PEG 7-NHBoc, jak i Tz-PEG 7-NH 2 na długości fali 525 nm.
nuta: Czasy retencji są w dużym stopniu zależne od wyposażenia HPLC każdego laboratorium (pompy, kolumny, rurki itp.), a przed oczyszczaniem należy przeprowadzić odpowiednie kontrole. Jednakże, dla przykładu, jeżeli stosuje się gradient od 5:95 MeCN/H2O (oba z 0,1% TFA) do 95:5 MeCN/H2O przez 30 minut, natężenie przepływu 1 mL/min i analityczną kolumnę C18 o wymiarach 4,6 mm x 250 mm, czasy retencji Tz-PEG 7-NHBoc i Tz-PEG7-NH 2 wynoszą około 18 min i 13 min, odpowiednio.
- Zebrać eluent HPLC zamrozić za pomocą ciekłego azotu i owinąć zamrożoną probówkę zbiorczą folią aluminiową. Umieść zamrożoną probówkę zbiorczą na liofilizatorze na noc, aby usunąć ruchomą fazę HPLC. Produkt będzie jasnoróżowym ciałem stałym.
- Rozpuścić produkt z kroku 3.7, Tz-PEG7-NH 2, w 150 μl DMSO i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.
- Zmierzyć stężenie Tz-PEG7-NH 2 za pomocą spektrofotometru UV-Vis monitorującego długość fali 525 nm. Współczynnik ekstynkcji molowej dla Tz-PEG7-NH 2 (ε525) wynosi 535 M-1 cm-1.
4. Synteza Tz-PEG 7-DOTA
- Rozpuścić Tz-PEG7-NH 2 (4,5 mg, 6,9 μmol) w 0,15 ml DMSO (lub postępować z roztworem utworzonym w kroku 3.8).
- Dodać 22 równoważniki molowe TEA (21 μl, 0,15 mmol) do roztworu zawierającego tetrazynę z kroku 4.1.
- Dodać 10 mg (14,2 μmol) p-SCN-Bn-DOTA w postaci stałej i mieszać roztwór przez około 2 minuty lub do całkowitego rozpuszczenia materiału.
- Pozostawić reakcję do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.
- Po 30 minutach rozcieńczyć reakcję w stosunku 1:1 wH2Oi oczyścić produkt za pomocą HPLC C18 z odwróconymi fazami w celu usunięcia nieprzereagowanego p-SCN-Bn-DOTA. p-SCN-Bn-DOTA może być monitorowany na długości fali 254 nm, podczas gdy Tz-PEG7-DOTA najlepiej monitorować na długości fali 525 nm.
nuta: Czasy retencji są oczywiście w dużym stopniu zależne od wyposażenia HPLC każdego laboratorium (pompy, kolumny, rurki itp.), a przed oczyszczaniem należy przeprowadzić odpowiednie kontrole. Jednak, aby przedstawić przykład, jeśli stosuje się gradient od 5:95 MeCN/H2O (oba z 0,1% TFA) do 95:5 MeCN/H2O przez 30 minut i stosuje się analityczną kolumnę C18 o wymiarach 4,6 x 250 mm, Tz-PEG7-DOTA i p-SCN-Bn-DOTA mają czasy retencji wynoszące odpowiednio około 15,6 min i 16,1 min.
- Zamrozić zebrany eluent HPLC za pomocą ciekłego azotu i owinąć zamrożoną probówkę zbiorczą folią aluminiową. Umieść zamrożoną probówkę zbiorczą na liofilizatorze na noc, aby usunąć ruchomą fazę HPLC. Produkt będzie jasnoróżowym pudrem.
- Rozpuść produkt w 0,15 ml DMSO i zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru UV-Vis monitorującego długość fali 525 nm. Molowy współczynnik ekstynkcji dla Tz-PEG7-DOTA (ε525) wynosi 535 M-1 cm-1.
- Przeanalizuj końcowy związek za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS), aby sprawdzić, czy synteza się powiodła. Patrz Tabela 1 dla eksperymentalnie wyznaczonych przesunięć chemicznych i mas cząsteczkowych wszystkich związków omówionych w tej pracy.
- Oczyszczony roztwór Tz-PEG7-DOTA należy przechowywać w ciemności w temperaturze -80 °C.
nuta: Jest to akceptowalny punkt zatrzymania procedury. Gotowy prekursor Tz-PEG7-DOTA jest stabilny przez co najmniej 1 rok w tych warunkach.
5. 177Lu Radioznakowanie Tz-PEG7-DOTA
UWAGA: Ten etap protokołu obejmuje obsługę i manipulację radioaktywnością. Przed wykonaniem tych kroków – lub wykonaniem jakichkolwiek innych prac związanych z radioaktywnością – naukowcy powinni skonsultować się z Departamentem Bezpieczeństwa Radiologicznego swojej instytucji macierzystej. Podejmij wszelkie możliwe kroki, aby zminimalizować narażenie na promieniowanie jonizujące.
UWAGA: Podczas pracy z małymi ilościami radiometali, zaleca się, aby wszystkie były wolne od śladowych ilości metali, aby zapobiec zakłóceniom w wiązaniu miejsca koordynacji.
- Do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml dodać 200 μl 0,25 M buforu octanu amonu dostosowanego porcjami 1 M HCl do pH 5,5,
nuta: W przypadku stosowania mniej niż 370 MBq aktywności do etykietowania, objętość użytego buforu powinna zostać zmniejszona do 100 μl.
- Dodać żądaną ilość [177Lu]LuCl3 do roztworu buforowego. Dodana ilość będzie zależała od liczby osób biorących udział w eksperymencie i podawanych dawek radioaktywnych. Zaleca się dodanie 1-2 dodatkowych dawek radioaktywności jako środka ostrożności w celu zrekompensowania potencjalnej utraty radioaktywności podczas etapów oczyszczania.
- Dodaj Tz-PEG7-DOTA w DMSO do mieszaniny radioaktywnej w kroku 5.2. Ilość Tz-PEG7-DOTA zależy od liczby badanych osób. Więcej szczegółów na ten temat można znaleźć w kroku 6.2.2.2.
- Pozostawić roztwór do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
- Sprawdzić, czy znakowanie radioaktywne zostało zakończone za pomocą natychmiastowej chromatografii cienkowarstwowej (radio-iTLC) z 50 mM EDTA, pH 5,5 jako fazą ruchomą. Oznaczone [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz pozostanie na linii podstawowej - Rf = 0 - podczas gdy wolne [177Lu]Lu3+ będzie koordynowane przez EDTA i będzie przemieszczać się z czołem rozpuszczalnika, Rf = 1,0 (Rysunek 1B).
- Jeśli nie zostanie osiągnięte znakowanie ilościowe, dodać ligandy w celu skoordynowania wolnego radiometalu. Alternatywnie, oczyść oznaczoną [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz za pomocą wkładu C18. Postępuj zgodnie z instrukcjami użytkowania producenta. Przykładowa procedura znajduje się poniżej.
- Zalej wkład, powoli przepuszczając 5 ml etanolu przez wkład za pomocą dużej strzykawki. Następnie przepuść przez 5 ml acetonitrylu, a następnie 5 ml dejonizowanego (DI)H2O.
- Pobrać roztwór radioliganda z kroku 5.3 do mniejszej strzykawki i powoli wstrzyknąć go do wkładu C18. Następnie przemyć wkład 10 ml DIH2O, aby usunąć wszelkie niezwiązane [177Lu]LuCl3.
- Eluować za pomocą 500 μl etanolu. Usunąć etanol z produktu końcowego, przepuszczając przez naczynie o niskim natężeniu przepływu suchego azotu lub argonu przez 10-15 minut. Następnie ponownie zawiesić radioligand w soli fizjologicznej w objętości określonej w kroku 6.2.2.2.
6. Badania in vivo
UWAGA: Podobnie jak w sekcji 5, ten krok protokołu obejmuje obsługę i manipulację radioaktywnością. Przed wykonaniem tych czynności badacze powinni skonsultować się z Departamentem Bezpieczeństwa Radiologicznego swojej instytucji macierzystej. Podejmij wszelkie możliwe kroki, aby zminimalizować narażenie na promieniowanie jonizujące.
- Przygotowanie zwierząt
- U samic nagich myszy atymicznych należy wszczepić podskórnie 5 x 106 komórek raka jelita grubego SW1222 zawieszonych w 150 μl mieszaniny pożywki komórkowej i macierzy 1:1 (np. Matrigel) i pozwolić im wyrosnąć w ksenoprzeszczep 100-150 mm3 (14-18 dni po inokulacji).
- Sortowanie zwierząt do eksperymentu biodystrybucji
- Gdy guzy osiągną wystarczającą wielkość, określoną za pomocą pomiaru suwmiarki, posortuj zwierzęta, aby upewnić się, że każda kohorta ma w przybliżeniu taką samą średnią objętość guza. Zwierzęta można odróżnić w każdej klatce po oznaczeniach na ogonie niezmywalnym tuszem (jedna opaska, dwie opaski itp.).
- Sortowanie zwierząt do badania terapii podłużnej
- Gdy guzy osiągną wystarczającą wielkość, określoną za pomocą pomiaru suwmiarki, przymocuj kolczyki do każdego ze zwierząt, aby zapewnić prawidłowe śledzenie przez cały czas trwania eksperymentu.
nuta: Numeryczne kolczyki mogą odpaść w trakcie trwania eksperymentu. W rezultacie, zaleca się, aby tym fizycznym znacznikom towarzyszyć nacięcia na uszy w sposób systematyczny (tj. prawy, lewy, dwustronny, prawy x 2, lewy x 2).
- Posortuj zwierzęta tak, aby średnia objętość guza w każdej kohorcie była mniej więcej równa. Poniższą metodę sortowania zwierząt można wykonać za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
- Wymień numery identyfikacyjne zwierząt, wzór wycięcia w uchu i objętość guza w trzech oddzielnych kolumnach.
- Sortuj dane od najmniejszej do największej objętości guza.
- W czwartej kolumnie przypisz każdemu zwierzęciu numer klatki i przechodź przez klatki w wężowy wzór. Na przykład, jeśli jest 5 klatek, ta kolumna będzie wypełniana "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5...", dopóki wszystkie zwierzęta nie zostaną przypisane do klatki.
- Po przypisaniu klatek posortuj dane według numeru klatki. Jeśli używane są nacięcia na uszy, upewnij się, że każde zwierzę w danej klatce ma unikalny wzór nacięcia na uszy. Jeśli duplikuje się (dwie lub więcej tego samego wzoru) w danej klatce, zamień jedną mysz na jedną z innej klatki z brakującym wzorem, aż każda klatka będzie zawierała zwierzęta z unikalnymi wzorami nacięć w uszach.
- Preparaty i iniekcje
nuta: Sekwencja wstrzykiwania zarówno w badaniu biodystrybucji, jak i terapii przebiega następująco: najpierw wstrzykuje się huA33-TCO, a następnie [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz po wcześniej ustalonym odstępie czasu.
- Immunokoniugat
- Rozcieńczyć podwielokrotność roztworu huA33-TCO z kroku 1.9 do stężenia 0,8 mg/ml w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
- Pobrać dawki 150 μl (100 μg) roztworu huA33-TCO do strzykawek potraktowanych 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i przechowywać te strzykawki na lodzie.
nuta: Leczenie BSA zmniejsza nieswoiste wiązanie przeciwciała ze ściankami strzykawki.
- Ogrzej zwierzę pod lampą grzewczą przez 3 minuty, aby rozszerzyć żyłę ogonową.
- Wstrzyknąć roztwór huA33-TCO do żyły ogonowej myszy z ksenograftem. Odczekaj 24 godziny (lub inny z góry określony przedział czasu), aby huA33-TCO zgromadził się w guzie myszy.
- Radioligand (Radioligand)
- Znakowanie radioaktywne Tz-PEG7-DOTA, jak opisano w rozdziale 5.
- Pobrać dawki w 150 μl 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej zawierającego 1,1 molowego odpowiednika Tz-PEG7-DOTA w stosunku do ilości podanego huA33-TCO. Na przykład, jeśli zwierzęciu wstrzyknięto 100 μg (0,67 nmol) huA33-TCO i wytworzono mieszaninę reakcyjną [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz o aktywności właściwej 12,4 GBq/μmol, wówczas zostaną pobrane dawki zawierające 9,14 MBq aktywności każda. Odpowiada to 0,74 nmol Tz (1,1 mola w stosunku do huA33-TCO).
- Ogrzej zwierzęta pod lampą grzewczą przez 3 minuty, aby rozszerzyć żyłę ogonową.
- Wstrzyknąć dawkę radioligandu do żyły ogonowej myszy z ksenoprzeszczepem. Ilość aktywności, która ma zostać wstrzyknięta, jest określana przez badacza. Opublikowane dane wykazały zależne od dawki efekty terapeutyczne na wielkość guza w zakresie 7,4 - 55,5 MBq.
