UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki pod wysterylizowanym dygestoriami zgodnie z Dobrą Praktyką Laboratoryjną (GLP).
1. Pobieranie i przechowywanie osocza
- Zebrać 3 ml próbki krwi obwodowej w probówce K3E EDTA.
- Odwirować probówkę w temperaturze pokojowej o stężeniu 1,880 x g przez 15 minut.
- Odzyskać osocze sklarowane nad osadem w podwielokrotnościach 450 μl.
- Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
UWAGA: Probówkę z krwią obwodową należy przetworzyć w ciągu 2 godzin od pobrania. Podczas pobierania osocza z probówki nie należy naruszać warstwy limfocytów.
2. Ekstrakcja krążących miRNA z próbek osocza
- Przygotuj wszystkie wymagane roztwory i rozmroź próbki do etapów ekstrakcji.
- Dodaj 375 μl 2-merkaptoetanolu do 2x roztworu denaturującego i dobrze wymieszaj.
- Dodaj 21 ml 100% etanolu klasy ACS do roztworu do płukania miRNA I i dobrze wymieszaj.
- Dodaj 40 ml 100% etanolu klasy ACS do roztworu myjącego 2/3 i dobrze wymieszaj.
- Pozostawić podwielokrotność osocza do rozmrożenia w temperaturze pokojowej, a następnie rozpocząć etapy ekstrakcji.
- Ekstrakcja organiczna
- Przenieść 400 μl próbki osocza do probówki o pojemności 2 ml wolnej od RNaz.
- Dodać 400 μl 2x roztworu denaturującego, wymieszać przez wirowanie i krótko odwirować.
- Dodać 4 μl 1 nM nakłucia, wymieszać przez wirowanie i krótko odwirować.
- Dodać 800 μl kwaśnego chloroformu fenolowego.
- Wirować przez 60 s i wirować z maksymalną prędkością (≥10 000 x g) przez 15 minut.
- Przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki. Nie zakłócaj interfazy. Zanotować odzyskaną objętość i wyrzucić probówkę zawierającą fazę niewodną.
nuta: 2x roztwór denaturujący jest przechowywany w temperaturze 4 °C i w tej temperaturze może zastygać. Przed użyciem podgrzać roztwór do temperatury 37 °C, od czasu do czasu mieszając przez 10-15 minut. Należy uważać, aby pobrać dolną fazę zawierającą kwaśny fenol-chloroform, a nie wodny bufor, który znajduje się na wierzchu mieszaniny. Podgrzej roztwór elucyjny lub wodę wolną od nukleaz do temperatury 95 °C. Należy uważać, aby podgrzać odpowiednią objętość roztworu (100 μl na próbkę + 10% nadmiaru).
- Małe wzbogacenie RNA
- Dodać 1/3 objętości etanolu 100% do fazy wodnej z kroku 2.2.6 i dokładnie wymieszać.
- Umieść wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej dla każdej próbki.
- Przenieść do 700 μl lizatu z kroku 2.3.1 i etanolu do wkładu filtracyjnego i odwirować przy 10 000 x g przez 30 s.
- Jeżeli pozostało >700 μl mieszaniny, umieścić filtrat w świeżej probówce i powtórzyć krok 2.3.3; powtarzać, aż cała mieszanina przejdzie przez wkład filtracyjny.
- Zmierzyć całkowitą objętość przepływu.
- Dodaj 2/3 objętości etanolu 100% do filtracji i dokładnie wymieszaj.
- Umieść drugi wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej.
- Przenieść do 700 μl objętości próbki do wkładu i odwirować przy 10 000 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ.
- Powtarzaj krok 1.3.8, aż cała mieszanina przejdzie przez wkład filtra.
- Nałożyć 700 μl roztworu do płukania miRNA 1 do wkładu filtrującego i odwirować wkład filtra z probówką zbiorczą o stężeniu 10 000 x g przez 15 s. Wyrzucić przepływ. Umieść wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.
- Nanieść 500 μl roztworu płuczącego 2/3 do wkładu filtracyjnego i odwirować wkład filtra z probówką zbiorczą o stężeniu 10 000 x g przez 15 s. Wyrzucić przepływ. Umieść wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej.
- Umieścić wkład filtra w świeżej probówce zbiorczej i powtórzyć krok 2.3.11 z 500 μl roztworu płuczącego 2/3. Wyrzuć przepływ i przenieś wkład filtra do świeżej probówki zbiorczej.
- Odwirować probówki z wkładami filtracyjnymi o sile 10 000 x g przez 1 min.
- Przenieść wkład filtra do świeżej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i dodać 100 μl podgrzanego (95 °C) roztworu elucyjnego lub wody wolnej od nukleaz.
- Wirować przy 10 000 x g przez 30 s w celu odzyskania miRNA i przechowywać w temperaturze -80 °C.
nuta: W roztworze płuczącym 2/3 może tworzyć się biały osad. Ten osad to nadmiar EDTA uwolniony z roztworu. Należy unikać pobierania tych kryształów na etapie pipetowania.
