$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Izolacja genomowego DNA z kału
UWAGA: Użyj komercyjnego zestawu do izolacji DNA drobnoustrojów z kału zgodnie z protokołem wykrywania patogenów w stolcu. Wyjmować próbki bezpośrednio z zamrażarki o temperaturze -80 °C i przechowywać je na suchym lodzie podczas ważenia.
- Przenieść do 220 mg stolca do czystej probówki do mikrodymu zawierającej 1,4 ml buforu do lizy stolca o temperaturze pokojowej (RT) (patrz Tabela materiałów).
- Wirować próbkę przez 1 minutę, aby dokładnie homogenizować ciała stałe (rysunek 1B). Podgrzewać zawiesinę do temperatury 95 °C przez 5 minut, aby zmylić wszystkie bakterie (w tym bakterie Gram-dodatnie).
- Wirować próbki przez 15 sekund, a następnie odwirować przy 20 000 x g przez 1 minutę w celu osadzenia kału. Przenieść supernatant do probówki do mikrofiltrów o pojemności 2 ml. Dodać jedną tabletkę do każdej próbki, aby wchłonąć inhibitory PCR, wirować aż tabletka się rozpuści i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
- Odwirować próbkę o masie 20 000 x g przez 3 minuty i przenieść supernatant do nowej probówki do mikrodymowania. Wirować przy 20 000 x g przez 3 min. Porcję 15 μl proteinazy K (zapas 20 mg/ml) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Odpipetować 200 μl próbki do probówki zawierającej proteinazę K.
- Dodać 200 μl buforu do lizy chlorku guanidyny do probówki, dokładnie wirować przez 15 s (patrz tabela materiałów) i inkubować próbkę w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Dodać 200 μl etanolu (96-100%) do probówek i dobrze wymieszać przez wirowanie.
- Umieść kolumnę wirową na bazie krzemionki w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i nałóż próbki na kolumnę. Zamknij pokrywę i odwiruj przez 1 minutę przy 20 000 x g.
- Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml i dodać 500 μl buforu płuczącego 1 do kolumny, zakryć kolumnę i odwirować przez 1 minutę przy 20 000 x g. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml i dodać do kolumny 500 μl buforu płuczącego 2, Zamknij nakrętkę i odwiruj przy 20 000 x g przez 3 minuty.
- Przy zamkniętej nasadce przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml i odwirować przez dodatkową 1 minutę przy 20 000 x g w celu usunięcia pozostałego buforu do płukania. Przenieść kolumnę do znakowanej 1,5 ml probówki do mikrofuge i eluować próbkę, dodając 200 μl buforu elucyjnego zawierającego EDTA do membrany (patrz tabela materiałów).
- Zamknąć nakrętkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Odwirować próbkę przez 1 minutę przy 20 000 x g. Wyrzucić kolumnę.
2. Oznaczanie stężenia DNA i przygotowanie próbki do PCR
UWAGA: Użyj fluorometru i dostępnego na rynku testu fluorescencyjnego dsDNA, aby określić stężenie genomowego DNA w każdej próbce (zobacz Tabelę Materiałów). Barwnik fluorescencyjny musi specyficznie wiązać dwuniciowe DNA.
- Przygotować rozcieńczenie 1:200 każdej próbki (1 μl każdej próbki w 199 μl mieszanki wzorcowej dsDNA) i rozcieńczenie wzorców 1:50. Analiza na fluorometrze przy użyciu ustawienia dsDNA.
Uwaga: Duża objętość DNA w PCR może działać hamująco, dlatego objętość użytego DNA nie może przekraczać 10% końcowej objętości PCR. Fluorometr umożliwia dokładny pomiar DNA w próbce, ponieważ tylko DNA związane z barwnikiem fluorescencyjnym będzie fluoryzować, eliminując ewentualny udział zanieczyszczeń w końcowym obliczonym stężeniu DNA. Ten poziom dokładnej oceny ilościowej ma zasadnicze znaczenie dla dalszego zastosowania sekwencjonowania.
- Przygotować matryce do PCR rozcieńczone do 5 ng/μl o odpowiedniej objętości 10 mM Tris, pH 8,5, aby przygotować robocze zapasy matryc dla każdej próbki.
- Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Zaprojektuj elementarze do pożądanych regionów V 16S
- Zaprojektuj startery, aby selektywnie wzmacniać pożądane regiony rRNA V 16S.
- Analizuj startery za pomocą Probe Match, z projektu Ribosomal Database Project, aby określić przybliżony współczynnik trafień dla różnych typów.
Uwaga: W przypadku regionów V1-V3 w obecnym badaniu wykorzystano opublikowane startery Bosshard forward, które wiążą się na pozycji 8 w regionie V1, oraz 533 reverse, które wiążą się na pozycji 533 w regionie V3. Podkłady muszą zawierać sekwencje adapterów zwisających do indeksowania.
- Projektując startery, należy uwzględnić sekwencje adapterów na końcach 5' każdego startera, zgodnie z zaleceniami dotyczącymi przygotowania biblioteki sekwencjonowania metagenomiki 16S (Tabela 1).
- Zsyntetyzuj te duże startery z oczyszczaniem wkładu. Rozpuść wysuszone startery i rozcieńczyć materiał roboczy PCR do 1 μM w 10 mM Tris, pH 8,5.
4. Amplicon PCR do wzmacniania regionu V z dołączonymi sekwencjami adapterów zwisu
- Ustawić mieszaninę reakcyjną amplikonów PCR zgodnie z opisem w Tabeli 2.
- Umieścić samoprzylepną przezroczystą plombę PCR na płytce i uruchomić amplikonową płytkę PCR, korzystając z parametrów podanych w tabeli 3.
- (Opcjonalnie) Uruchom produkty amplikonu PCR na żelu agarozowym lub teście DNA o wysokiej czułości, który umożliwia ilościowy pomiar wielkości amplikonu (patrz Tabela materiałów).
Uwaga: Wielkość amplikonu z tego badania wynosi 550 pz (ryc. 2a).
5. Czyszczenie PCR za pomocą kulek magnetycznych
- Szybko odwirować płytkę amplikonową PCR przy 1 000 x g przez 1 minutę w celu zebrania kondensacji.
nuta: Zamiast płytek do PCR można używać pasków probówek do PCR, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Wyrzuć pokrywki tubek i nigdy nie używaj ich ponownie.
- Wiruj kulki magnetyczne, aby równomiernie je rozproszyć i dodaj 20 μl kulek magnetycznych do każdej studzienki amplikonowej PCR, a następnie powoli pipetuj całą objętość w górę iw dół 10 razy.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieścić płytkę PCR na stojaku magnetycznym na 2 minuty, aż do zebrania kulek magnetycznych i uzyskania klarowności supernatantu. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
- Umyj koraliki 200 μl świeżego 80% etanolu, gdy płytka PCR znajduje się na stojaku magnetycznym i inkubuj przez 30 s w temperaturze pokojowej na stojaku magnetycznym. Ostrożnie usunąć supernatant.
- Powtórz pranie po raz drugi. Teraz użyj cienkiej końcówki pipety, aby usunąć resztki etanolu ze studzienek i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
- Wyjmij płytkę PCR ze stojaka magnetycznego i dodaj 52,5 μl 10 mM Tris pH 8,5 do każdej studzienki. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby zawiesić kulki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
- Przenieść płytkę PCR na stojak magnetyczny w celu zebrania kulek magnetycznych i przeniesienia 50 μl supernatantu na czystą płytkę PCR. Umieścić na niej samoprzylepną, przezroczystą uszczelkę PCR i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego tygodnia.
| Startery PCR Amplicon |
| naprzód | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' |
| rewers | 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' |
| Sekwencje specyficzne dla locus są pokazane pogrubioną czcionką, a niepogrubiona to sekwencja adaptera zwisu. |
Tabela 1: Startery Amplicon PCR.
| Konfiguracja reakcji Amplicon PCR | |
| głośność |
| DNA drobnoustrojów (5ng/μl) | 2,5 μl |
| Podkład do przodu (1 μM; od kroku 3.1) | 5,0 μl |
| Podkład odwrotny (1 μM; od kroku 3.1) | 5,0 μl |
| 2X HotStart Gotowa Mieszanka | 12,5 μl |
| łączny | 25,0 μl |
Tabela 2: Startery Amplicon PCR.
| Konfiguracja PCR Amplicon |
| 95 °C przez 3 minuty | |
| 25 cykli: | |
| 95 °C przez 30 sekund |
| 55 °C przez 30 sekund |
| 72 °C przez 60 sekund |
| 72 °C przez 3 minuty | |
| Przechowywać w temperaturze 4 °C | |
Tabela 3: Konfiguracja programu Amplicon PCR.
