1. Wytwarzanie organoidów CRC hodowanych na sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej
Procedury eksperymentalne dla hodowli organoidów CRC PDX jelita grubego są przedstawione na rysunku 1B (krok 4).
- Ustalić pożywkę odpowiednią dla organoidów CRC pochodzących z PDX (patrz tabela materiałów, "pożywka do hodowli organoidów CRC") przy użyciu pożywek opisanych wcześniej dla organoidów jelita grubego u ludzi.
- Nałożyć 150 μl sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej (patrz tabela materiałów) na studzienkę na 12-dołkową płytkę na lodzie, a następnie inkubować ją przez 30-60 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 w celu zestalenia żeli.
- Zawiesić osad komórkowy komórek CRC uzyskanych z mysiego modelu PDX za pomocą pożywki do hodowli organoidów CRC (od kroku 1.1) z 5% FCS, aby dostosować się do 3 x 105 komórek/ml. Następnie wysiewa się 1 ml pożywki na sztuczną płytkę pokrytą matrycą zewnątrzkomórkową przygotowaną w kroku 1.2 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 . Użyj hemocytometru do zliczenia liczby komórek nowotworowych, w tym pojedynczych komórek i klastrów wielokomórkowych (grupa przylegających komórek) w zawiesinie komórki.
UWAGA: 5% FCS służy do wygaszania resztkowej aktywności enzymatycznej kolagenazy w tym badaniu.
- Następnego dnia ostrożnie zebrać pożywkę hodowlaną, w tym pływające komórki odłączone od sztucznej płytki pokrytej matrycą zewnątrzkomórkową, do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować ją przy 1 400 x g przez 5 minut. Następnie usunąć sklarat nad osadem i ponownie zawiesić osad w 70 μl sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej na lodzie.
- Aby zwiększyć żywotność komórek CRC, nałóż sztuczną macierz zewnątrzkomórkową zawierającą komórki nowotworowe na komórki organoidów nowotworowych przyczepione do sztucznej płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową i inkubuj przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 , zestal sztuczną powłokę macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie inkubować go z 1 ml pożywki do hodowli komórek organoidowych CRC z 1% FCS w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
- Zmieniaj pożywkę co drugi dzień. Ponieważ organoidy CRC wypełniają pożywkę, może okazać się konieczna codzienna zmiana pożywki.
2. Wytwarzanie i wzbogacanie cząstek lentiwirusowych GFP
Eksperymentalne procedury generowania i wzbogacania cząstek lentiwirusa GFP są przedstawione na rysunku 1C (krok 5).
- Hodowla HEK293T komórek za pomocą pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 zawierającej 10% FCS i przygotowanie sześciu 10-centymetrowych szalek (2 x 106 komórek na szalkę) do następnej procedury transfekcji.
- Do transfekcji na szalkę należy przygotować 500 μl mieszaniny, w tym 20 μl odczynnika do transfekcji w DMEM z wektorem PRRL-GFP (5 μg) i dwoma plazmidami lentiwirusowymi, takimi jak pCMV-VSV-G (1 μg) i pCMV-dR8,2 dvpr (5 μg), w sterylnej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie nałóż ją na każdą z 10-centymetrowych szalek i inkubuj je przez 18 godzin.
- Usuń pożywkę, dodaj 5 ml świeżej pożywki 10% FCS-RPMI 1640 do każdego dania i odstaw na 24 godziny.
- Zebrać kondycjonowaną pożywkę z każdej pożywki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przechowywać łącznie 30 ml pożywki w temperaturze 4 °C przez noc. Dodaj 5 ml świeżego RPMI 1640 do każdego naczynia i odstaw na 24 godziny.
- Zebrać kondycjonowaną pożywkę z każdego naczynia do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przechowywać łącznie 30 ml pożywki na lodzie. Następnie wyrzuć komórki.
- Przefiltrować 60 ml pożywki (z etapów 2.4-2.5) przez filtr 0,45 μm, aby usunąć komórki i podzielić tę ilość na dwanaście probówek wirówek polipropylenowych o pojemności 5 ml do ultrawirowania.
- W celu zagęszczenia wirusów należy je odwirować za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego o sile 85 327 x g przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C.
- Natychmiast usuń podłoże. W celu rozpuszczenia zagęszczonego wirusa należy umieścić 250 μl pożywki z mieszanki szynki F-12 (F12)/DMEM bez FCS w każdej z dwunastu probówek i utrzymywać ją w temperaturze 4 °C przez noc. Należy pamiętać, że osad wirusa jest często niewidoczny.
- Delikatnie odpipetować pożywkę, aby zebrać 3 ml stężonego 5 razy więcej lentiwirusa GFP, w sumie, przypuszczalnie zawierając cząstki lentiwirusa GFP z 108 jednostkami transdukcyjnymi na ml (TU/ml). Następnie należy przechowywać dwanaście mikroprobówek o pojemności 1,5 ml (w tym 250 μl na probówkę) w sterylnych warunkach w temperaturze -80 °C przez okres do roku. Przygotuj wiele małych porcji oryginalnego roztworu, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
3. Znakowanie komórek organoidowych CRC cząstkami lentiwirusa GFP hodowanymi na sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej
Eksperymentalne procedury znakowania komórek organoidowych CRC lentiwirusem GFP są przedstawione na rysunku 1C (krok 6).
- Pozwól organoidom CRC przygotowanym w kroku 1.6 rosnąć bez zakłóceń przez 7-10 dni, zbierz je mechanicznie za pomocą sterylnego skrobaka do komórek i przenieś do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
nuta: Wzrost organoidów CRC w hodowli zależy od charakteru pierwotnych guzów od pacjentów. Unikaj przerostu organoidów CRC, utrzymując je w 60-70% konfluencji przed przeniesieniem w stosunku 1:2 na nową sztuczną 12-dołkową płytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową.
- Wirować mikroprobówkę przez 3 minuty przy 1 400 x g, usunąć pożywkę hodowlaną i rozpuścić osad komórkowy w 500 μl PBS przez delikatne stukanie.
- Wirować mikroprobówkę przez 3 minuty przy 1 400 x g i wyeliminować PBS.
- Aby oddzielić przylegające organoidy CRC, dodaj 500 μl roztworu enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych do oddzielania komórek do osadu komórkowego w probówce i wymieszaj go, delikatnie stukając. Następnie pozostaw probówki na 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Bardzo delikatnie odpipetować zawiesinę komórek dodatkowymi 500 μl 1% FCS-DMEM kilka razy w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, aby z grubsza zdysocjować komórki. Wytwarzanie pojedynczych komórek z organoidów CRC przez ostre pipetowanie znacznie zmniejsza żywotność komórek. W związku z tym ważne jest, aby masa komórek była wizualnie wykrywalna w zawiesinie komórek poprzez delikatne pipetowanie do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
- Odwirować zawiesinę komórek przez 3 minuty przy sile 1 400 x g i usunąć supernatant.
- Rozpuścić osad komórkowy mieszaniną 100 μl 5x lentiwirusa GFP (>10,8 TU/ml) i 400 μl pożywki do hodowli organoidów CRC w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, delikatnie stukając, aby dostosować do stężenia 5 x 105 zdysocjowanych komórek nowotworowych na 500 μl. Użyj hemocytometru do zliczenia liczby komórek nowotworowych, w tym pojedyncze komórki i grupy komórek w zawiesinie komórek, jak opisano powyżej (krok 1.3).
- Przygotować sztuczną 12-dołkową płytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową, zgodnie z opisem w kroku 1.2. Następnie umieścić 500 μl zawiesiny komórek przygotowanej w kroku 3.7 na płytce i pozostawić na 18 godzin w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
- Zebrać pożywkę z pływającymi komórkami odłączonymi od sztucznej płytki pokrytej matrycą zewnątrzkomórkową do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować go przy 1 400 x g, a następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 70 μl sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej na lodzie.
- Aby zwiększyć żywotność komórek CRC, nałóż sztuczną macierz zewnątrzkomórkową zawierającą komórki nowotworowe na organoidy nowotworowe przyczepione do 12-dołkowej płytki pokrytej sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową, jak opisano w kroku 1.5. Następnie inkubować płytkę przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu zestalenia powłoki sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie hodować ją z 1 ml pożywki do hodowli organoidów CRC z 1% FCS w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .
- Obserwuj komórki trzy dni po zakażeniu pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić prawie 100% dodatni wynik GFP dzięki zastosowaniu wysokiego miana cząstek lentiwirusa (patrz ryc. 2A).
- Hoduj organoidy CRC przez 7-10 dni, aby zwiększyć wzrost komórek przed wstrzyknięciem myszom biorcy.
