$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Analiza CRC PDX od myszy
Eksperymentalne procedury preparacji CRC PDX są przedstawione na rysunku 1B (krok 2).
- Pozwól guzowi urosnąć podskórnie do wielkości ~1cm3, co zwykle trwa około 1-3 miesięcy.
- Znieczulić mysz inhalacją izofluranu za pomocą urządzenia do znieczulania wziewnego dla małych zwierząt i zdezynfekować skórę 70% etanolem.
- Umieść mysz w pozycji leżącej na stole laboratoryjnym. Naciąć skórę, odsłonić guz i ostrożnie oderwać skórę od guza za pomocą sterylnych nożyczek. Po usunięciu guza umieść go na 10 cm szalce Petriego, usuń wszelkie rażąco martwicze obszary z guza, a następnie przepłucz dwukrotnie 5 ml PBS.
nuta: Obszary nekrotyczne są często bielsze, bardziej miękkie i kruche niż otaczające je obszary.
- Umieść guz na lodzie i podziel go równo na co najmniej 4 części do różnych zastosowań, w tym 1) hodowlę organoidów CRC, 2) przeszczep do myszy wtórnych, 3) badanie histologiczne oraz 4) zamrażanie i przechowywanie fragmentów guza.
- W celu wytworzenia organoidów CRC należy umieścić litą tkankę nowotworową na 6-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 1 ml sterylnego PBS. Trzymaj chusteczkę na lodzie do czasu przetworzenia.
- Aby ustalić model PDX dla ludzkiego CRC, należy przenieść świeże CRC PDX do myszy wtórnej. Pokrój tkankę nowotworową na małe kawałki (5 x 5 x 5 mm o rozmiarze3) za pomocą sterylnych żyletek i delikatnie zanurz te fragmenty tkanki w 50 μl sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie wszczepij te fragmenty w dolną część prawej i lewej kieszeni podskórnej myszy NOG
.
- Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na stole laboratoryjnym. Wykonaj małe nacięcie w dolnej części prawego i lewego boku myszy biorcy, aby wygenerować kieszenie podskórne do implantacji tkanek za pomocą sterylnych nożyczek. Uważaj, aby nie przebić błony otrzewnej. Podczas tej procedury krwawienie powinno być niewielkie.
- Delikatnie zanurz wyżej przygotowane fragmenty guza w 50 μl sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie wszczepij je w dolne części prawej i lewej kieszonki podskórnej.
- Zszyj nacięcie klipsami do ran u myszy poddawanych zabiegom chirurgicznym. Upewnij się, że wszczepione tkanki nowotworowe znajdują się w pewnej odległości od nacięcia pod skórą.
nuta: Zgodnie z minimalizacją zabiegów chirurgicznych, w tym badaniu nie stosowano leczenia bólu pooperacyjnego i infekcji.
- Umieść mysz na ciepłej podkładce i utrzymuj pozycję leżącą mostka, aż do przywrócenia wystarczającej świadomości. Po całkowitym wyzdrowieniu i możliwości siedzenia na wszystkich czterech nogach, myszy mogą wrócić do swoich domowych klatek. Aby zapobiec drapieżnictwu, nie zezwalaj na rozmnażanie ze zwierzętami nieoperowanymi w tej samej klatce.
- Do analizy histologicznej należy umieścić próbki w 5 ml 10% obojętnej buforowanej formaliny w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej przez 2 dni.
- W celu krioprezerwacji pokrój tkankę nowotworową na małe kawałki (5 x 5 x 5 mm3 w rozmiarze) i delikatnie zanurz próbki w 500 μl roztworu do zamrażania komórek w probówkach kriowialnych o pojemności 1-1,5 ml. Następnie przenieś probówkę do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
2. Ekstrakcja PDX do zawiesiny komórkowej w hodowli organoidów CRC
Eksperymentalne procedury dysocjacji CRC PDX są przedstawione na rysunku 1B (krok 3).
- Umieść powyższe (krok 1.4.1) przygotowane fragmenty guza na 10 cm szalce Petriego.
- Zmiel fragmenty za pomocą sterylnych żyletek i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS)-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z 80 μl bulionu enzymatycznego kolagenazy (patrz tabela materiałów).
- Zamknij szczelnie tubkę i owiń nakrętkę parafilmem, aby zapobiec wyciekowi. Aby zdysocjować zmielone fragmenty guza do zawiesiny komórkowej, należy ją delikatnie mieszać przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Należy pamiętać, że w probówce nadal pozostanie wiele fragmentów niestrawionej tkanki.
- Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Rozpuścić osad komórkowy za pomocą 10 ml 10% FCS-DMEM, aby uzyskać zawiesinę komórek.
- Aby wyeliminować niestrawione resztki tkanek, należy dwukrotnie przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka komórkowego o wielkości 40 μm ustawionego na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Następnie odwirować przepływ przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i utrzymać osad na lodzie.
3. Generacja organoidów CRC hodowanych na sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej
Procedury eksperymentalne dla hodowli organoidów CRC PDX jelita grubego są przedstawione na rysunku 1B (krok 4).
- Ustalić pożywkę odpowiednią dla organoidów CRC pochodzących z PDX (patrz tabela materiałów, "pożywka do hodowli organoidów CRC") przy użyciu pożywek opisanych wcześniej dla organoidów jelita grubego u ludzi.
- Nałożyć 150 μl sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej (patrz tabela materiałów) na studzienkę na 12-dołkową płytkę na lodzie, a następnie inkubować ją przez 30-60 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 w celu zestalenia żeli.
- Zawiesić osad komórkowy od kroku 2.5 za pomocą pożywki do hodowli organoidów CRC (od kroku 3.1) z 5% FCS, aby uzyskać dostosowanie do 3 x 105 komórek/ml. Następnie wysiewać 1 ml pożywki na sztuczną płytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową, przygotowaną w kroku 3.2. i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 . Użyj hemocytometru do zliczenia liczby komórek nowotworowych, w tym pojedynczych komórek i klastrów wielokomórkowych (grupa przylegających komórek) w zawiesinie komórki.
UWAGA: 5% FCS służy do wygaszania resztkowej aktywności enzymatycznej kolagenazy w tym badaniu.
- Następnego dnia ostrożnie zebrać pożywkę hodowlaną, w tym pływające komórki odłączone od sztucznej płytki pokrytej matrycą zewnątrzkomórkową, do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować ją przy 1 400 x g przez 5 minut. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 70 μl sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie.
- Aby zwiększyć żywotność komórek CRC, nałóż sztuczną macierz zewnątrzkomórkową zawierającą komórki nowotworowe na komórki organoidów nowotworowych przyczepione do sztucznej płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową i inkubuj przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 , zestal sztuczną powłokę macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie inkubować go z 1 ml pożywki do hodowli komórek organoidowych CRC z 1% FCS w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
- Zmieniaj pożywkę co drugi dzień. Ponieważ organoidy CRC wypełniają pożywkę, może okazać się konieczna codzienna zmiana pożywki.
4. Wytwarzanie i wzbogacanie cząstek lentiwirusowych GFP
Eksperymentalne procedury generowania i wzbogacania cząstek lentiwirusa GFP są przedstawione na rysunku 1C (krok 5).
- Hodowla HEK293T komórek za pomocą pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 zawierającej 10% FCS i przygotowanie sześciu 10-centymetrowych szalek (2 x 106 komórek na szalkę) do następnej procedury transfekcji.
- Do transfekcji na szalkę należy przygotować 500 μl mieszaniny, w tym 20 μl odczynnika do transfekcji w DMEM z wektorem PRRL-GFP (5 μg)12 i dwoma plazmidami upakowania lentiwirusa, takimi jak pCMV-VSV-G (1 μg) i pCMV-dR8,2 dvpr (5 μg), w sterylnej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie nałóż ją na każdą z 10-centymetrowych szalek i inkubuj je przez 18 godzin.
- Usuń pożywkę, dodaj 5 ml świeżej pożywki 10% FCS-RPMI 1640 do każdego dania i odstaw na 24 godziny.
- Zebrać kondycjonowaną pożywkę z każdej pożywki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przechowywać łącznie 30 ml pożywki w temperaturze 4 °C przez noc. Dodaj 5 ml świeżego RPMI 1640 do każdej potrawy i odstaw na 24 godziny.
- Zebrać kondycjonowaną pożywkę z każdego naczynia do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przechowywać łącznie 30 ml pożywki na lodzie. Następnie wyrzuć komórki.
- Przefiltrować 60 ml pożywki (z etapów 4.4-4.5) przez filtr 0,45 μm, aby usunąć komórki i podzielić tę ilość na dwanaście probówek wirówek polipropylenowych o pojemności 5 ml do ultrawirowania.
- W celu zagęszczenia wirusów należy je odwirować za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego (patrz tabela materiałów) przy 85,327 x g przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C.
- Natychmiast usuń podłoże. W celu rozpuszczenia zagęszczonego wirusa należy umieścić 250 μl pożywki z mieszanki szynki F-12 (F12)/DMEM bez FCS w każdej z dwunastu probówek i utrzymywać ją w temperaturze 4 °C przez noc. Należy pamiętać, że osad wirusa jest często niewidoczny.
- Delikatnie odpipetować pożywkę, aby zebrać 3 ml stężonego 5 razy więcej lentiwirusa GFP, w sumie, przypuszczalnie zawierając cząstki lentiwirusa GFP z 108 jednostkami transdukcyjnymi na ml (TU/ml). Następnie należy przechowywać dwanaście mikroprobówek o pojemności 1,5 ml (w tym 250 μl na probówkę) w sterylnych warunkach w temperaturze -80 °C przez okres do roku. Przygotuj wiele małych porcji oryginalnego roztworu, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
5. Znakowanie komórek organoidowych CRC cząstkami lentiwirusa GFP hodowanymi na sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej
Eksperymentalne procedury znakowania komórek organoidowych CRC lentiwirusem GFP są przedstawione na rysunku 1C (krok 6).
- Pozwól organoidom CRC przygotowanym w kroku 3.6 rosnąć bez zakłóceń przez 7-10 dni, zbierz je mechanicznie za pomocą sterylnego skrobaka do komórek, a następnie przenieś do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
nuta: Wzrost organoidów CRC w hodowli zależy od charakteru pierwotnych guzów od pacjentów. Unikaj przerostu organoidów CRC, utrzymując je w 60-70% konfluencji przed przeniesieniem w stosunku 1:2 na nową sztuczną 12-dołkową płytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową.
- Wirować mikroprobówkę przez 3 minuty przy 1 400 x g, usunąć pożywkę hodowlaną i rozpuścić osad komórkowy w 500 μl PBS przez delikatne stukanie.
- Wirować mikroprobówkę przez 3 minuty przy 1 400 x g i wyeliminować PBS.
- Aby oddzielić przylegające organoidy CRC, dodaj 500 μl roztworu enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych do oddzielania komórek do osadu komórkowego w probówce i wymieszaj go, delikatnie stukając. Następnie pozostaw probówki na 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Bardzo delikatnie odpipetować zawiesinę komórek dodatkowymi 500 μl 1% FCS-DMEM kilka razy w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, aby z grubsza zdysocjować komórki. Wytwarzanie pojedynczych komórek z organoidów CRC przez ostre pipetowanie znacznie zmniejsza żywotność komórek. W związku z tym ważne jest, aby masa komórek była wizualnie wykrywalna w zawiesinie komórek poprzez delikatne pipetowanie do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
- Odwirować zawiesinę komórek przez 3 minuty przy sile 1 400 x g i usunąć supernatant.
- Rozpuść osad komórkowy mieszaniną 100 μl 5x lentiwirusa GFP (>10,8 TU/ml) i 400 μl pożywki do hodowli organoidów CRC w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, delikatnie stukając, aby dostosować do stężenia 5 x 105 zdysocjowanych komórek nowotworowych na 500 μl. Użyj hemocytometru do zliczenia liczby komórek nowotworowych, w tym pojedyncze komórki i grupy komórek w zawiesinie komórek, jak opisano powyżej (krok 3.3).
- Przygotować sztuczną płytkę 12-dołkową pokrytą matrycą zewnątrzkomórkową, zgodnie z opisem w kroku 3.2. Następnie umieścić 500 μl zawiesiny komórek przygotowanej w kroku 5.7 na płytce i pozostawić na 18 godzin w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
- Zebrać pożywkę z pływającymi komórkami odłączonymi od sztucznej płytki pokrytej matrycą zewnątrzkomórkową do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować go przy 1 400 x g, a następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 70 μl sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie.
- Aby zwiększyć żywotność komórek CRC, nałóż sztuczną macierz zewnątrzkomórkową zawierającą komórki nowotworowe na organoidy nowotworowe przyczepione do 12-dołkowej płytki pokrytej sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową, jak opisano w kroku 3.5. Następnie inkubować płytkę przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu zestalenia powłoki sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie hodować ją z 1 ml pożywki do hodowli organoidów CRC z 1% FCS w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .
- Obserwuj komórki po 3 dniach od zakażenia pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić prawie 100% dodatni wynik GFP dzięki zastosowaniu wysokiego miana cząstek lentiwirusa (patrz ryc. 2A).
- Hoduj organoidy CRC przez 7-10 dni, aby zwiększyć wzrost komórek przed wstrzyknięciem myszom biorcy.
6. Generowanie przerzutów przez organoidy CRC znakowane GFP u myszy biorców
Eksperymentalne procedury generowania przerzutów przy użyciu organoidów CRC znakowanych GFP są przedstawione na rysunku 1C (krok 7).
- Aby oddzielić organoidy CRC znakowane GFP od zawiesiny komórkowej, należy je zebrać mechanicznie za pomocą sterylnego skrobaka do komórek i przenieść do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml, jak opisano powyżej (krok 5.1).
- Odwirować mikroprobówkę przez 3 minuty przy 1 400 x g, usunąć pożywkę hodowlaną i rozpuścić osad komórkowy w 500 μl PBS przez delikatne stukanie.
- Wirować mikroprobówkę przez 3 minuty przy 1 400 x g i wyeliminować PBS.
- Nałożyć 500 μl roztworu oddzielającego komórki na osad komórkowy w probówce i wymieszać go przez delikatne stukanie. Następnie pozostawić mieszaninę na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu enzymatycznego dysocjacji przylegających organoidów CRC, jak opisano powyżej (krok 5.4).
- Bardzo delikatnie odpipetować zawiesinę komórek dodatkowymi 500 μl 1% FCS-DMEM kilka razy w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, aby z grubsza zdysocjować komórki, jak opisano powyżej (krok 5.5). Wytwarzanie pojedynczych komórek z organoidów CRC przez ostre pipetowanie znacznie zmniejsza żywotność komórek. W ten sposób pozostaw masę komórek wizualnie wykrywalną w zawiesinie komórek, delikatnie pipetując w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.
- Odwirować zawiesinę komórek przez 3 minuty przy sile 1 400 x g i usunąć supernatant.
- Aby ustalić mysi model spontanicznych przerzutów CRC PDX:
- Przygotuj zawiesinę komórkową zawierającą 5 x 105 komórek w 50 μl PBS z 50% sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową na mysz. Przed użyciem utrzymać zawiesinę na lodzie. Użyj hemocytometru do zliczenia komórek rakowych, jak wskazano w kroku 3.3.
- Znieczulić mysz inhalacją izofluranu za pomocą urządzenia do znieczulania wziewnego dla małych zwierząt i zdezynfekować skórę 70% etanolem. Upewnij się, że oddychanie jest normalne i głębokie oraz że nie ma odruchu szczypania palców u nóg w celu prawidłowego znieczulenia. Maść weterynaryjna na oczy to opcja, aby zapobiec suchości oczu podczas znieczulenia.
- Umieść mysz NOG w pozycji leżącej na stole laboratoryjnym. Chwyć błonę śluzową odbytnicy sterylną pęsetą i delikatnie wyciągnij ją z odbytu. Następnie należy natychmiast wstrzyknąć zawiesinę komórkową przygotowaną w kroku 6.7.1 do błony podśluzowej odbytnicy myszy za pomocą strzykawki (rozmiar igły: 22 G). Rutynowo do oceny wyników używa się 4-6 myszy na grupę.
