Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Generowanie przerzutów przez organoidy CRC znakowane GFP u myszy biorców
- Aby ustalić eksperymentalny model przerzutów CRC PDX:
- Przygotować zawiesinę komórek organoidowych CRC, zawierającą 4 x 104 komórki w 50 μl PBS na mysz. Przed użyciem utrzymać zawiesinę na lodzie. Użyj hemocytometru do zliczenia komórek rakowych. (Policz liczbę komórek nowotworowych, w tym pojedynczych komórek i wielokomórkowych klastrów w zawiesinie komórki).
- Znieczulić mysz inhalacją izofluranu za pomocą urządzenia do znieczulania wziewnego dla małych zwierząt i zdezynfekować skórę 70% etanolem. Upewnij się, że oddychanie jest normalne i głębokie oraz że nie ma odruchu szczypania palców u nóg w celu prawidłowego znieczulenia. Maść weterynaryjna na oczy jest opcją, aby zapobiec suchości oka podczas znieczulenia.
- Umieść znieczuloną mysz NOG w pozycji leżącej na stole laboratoryjnym. Wykonaj małe nacięcie w dolnej części lewego boku, a następnie przetnij otrzewną, aby ostrożnie odsłonić śledzionę za pomocą sterylnych nożyczek i pęsety. Chwycić tkankę tłuszczową przyczepioną do śledziony sterylną pęsetą, a następnie powoli wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej (przygotowanej jak powyżej, krok 1.1) do śledziony. Należy upewnić się, że zawiesina komórkowa jest wstrzykiwana prawidłowo, bez wycieku na zewnątrz, ze śledziony. Rutynowo do oceny wyników używa się 4 myszy na grupę.
- Po operacji umieść wszystkie myszy na ciepłej podkładce i utrzymuj w pozycji leżącej mostka, aż do przywrócenia wystarczającej świadomości. Gdy myszy w pełni wyzdrowieją i będą w stanie usiąść na wszystkich czterech nogach , przywróć je do klatek domowych. Aby zapobiec drapieżnictwu, nie zezwalaj na rozmnażanie ze zwierzętami nieoperowanymi w tej samej klatce.
- Sprawdź, czy nie ma wycieku szwów i upewnij się, że myszy żyją w grupie leczonej chirurgicznie następnego dnia. Sprawdzaj myszy pod kątem oznak choroby i mierz rozmiary guza za pomocą suwmiarki u wszystkich myszy raz w tygodniu.
- Obserwuj myszy w celu wykrycia spontanicznych przerzutów (przez okres do 2,5 miesiąca) i eksperymentalnych przerzutów (1 miesiąc) po wstrzyknięciu.
- Poświęć myszy poprzez znieczulenie i zwichnięcie szyjki macicy we wskazane dni. Wypreparuj pierwotne guzy i różne tkanki, w tym wątrobę i płuca. Umieść wypreparowane guzy i narządy w 5 ml lodowatego PBS na 10-centymetrowej szalce Petriego i przechowuj je na lodzie.
- Aby wykryć komórki organoidowe CRC GFP-dodatnie, obserwuj wypreparowane tkanki pod mikroskopem stereofluorescencyjnym. Rejestruj obrazy za pomocą kamery CCD i przygotuj je za pomocą standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazu
